材料和试剂

稳定的Pt-GFP转基因野生型系N9561（背景：Col-0）得自诺丁汉拟南芥库存中心（Nottingham Arabidopsis Stock Center） NASC_id = 9561"> http://arabidopsis.info/StockInfo?NASC_id=9561 ）。
注意：Pt-GFP T-DNA插入突变体纯合子通过将T-DNA插入突变体（您感兴趣，这里指具有根毛生长问题的突变体）与N9561杂交获得。我们首先通过PCR获得T-DNA插入纯合子（ http ：//signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress ），我们检查了Pt-GFP的荧光。具有荧光的纯合系将用于以后的分析。
digitonin（Sigma-Aldrich，目录号：11024-24-1）
注意：风险评估：有毒。在使用此化学品时，吸入有毒，吸入皮肤，戴防护手套和衣服，戴呼吸防护用品。
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（Sigma-Aldrich，目录号：145224-94-8）
N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：7365-45-9）
Murashige和Skoog（MS）培养基（Phyto Tech，目录号：M519）
pH缓冲溶液（参见配方）

设备

软件

程序

将表面灭菌的拟南芥种子播种在0.5×MS培养基上，并在4℃在黑暗中保持3天。然后将板在22℃下用16小时光/8小时黑暗光周期转移到生长室中并垂直生长。 Pt-GFP 4-5-d龄幼苗的根毛用于监测细胞内pH。将幼苗小心地置于载有2-3滴液体生长培养基（与培养基幼苗生长相同）上的载玻片上。在共焦显微镜下（激发子：405nm和488nm;发射器：525nm）监测根毛GFP荧光;使用F405至F488比率作为pH的测量，并且可以获得伪彩色编码的405nm/488nm比的图像。
如先前报道的（Moseyko和Feldman，2001）原位进行pH滴定。为了制备校准曲线，使用一系列pH缓冲溶液（5,5.5,6,6.5,7,7.5和8;用于制备，参见Recipes），将4-5天龄的幼苗在缓冲溶液并稳定约10分钟以平衡外部pH缓冲溶液和pHc。如程序1进行荧光，以获得不同pH缓冲溶液的F405至F488比例。对于每个，至少应重复5次。
在原位滴定之后，将使用Microsoft Excel将荧光比转换为pH值的方程式（R近似为0.999）。步骤中获得的根毛的pH水平 1然后通过公式校准
废物处理
向经许可的处理公司提供含有洋地黄皂苷的剩余和不可回收解决方案。联系专业废物处理服务处理此材料。

代表数据

图1. Pt-GFP植物根毛中的pHc。棒=10μm

食谱

pH缓冲溶液
0.5×Murashige和Skoog基础盐混合物（MS）盐
0.005％的洋地黄素
50mM MES/NaOH（用于调节pH至5,5.5,6,6.5）或20mM HEPES/NaOH（pH至7,7.5,8）

致谢

这项工作得到国家关键基本特别基金（2012CB1143001）的支持。

参考文献