材料和试剂

人包皮成纤维细胞（HFF）细胞培养物（ATTC，目录号：SCRC-1042）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，目录号：41966-029/052）
胎牛血清（FBS）（Eurobio ，目录号：CVFSVF0001）
青霉素/链霉素（PAN Biotech GmbH，目录号：P0607-100）
L-谷氨酰胺（200mM）（Life Technologies，目录号：25030-024）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Life Technologies，目录号：14190-094/069）
蛋白酶K（分子生物学级）（Bio-Rad Laboratories，目录号：P8107S，批号：0051310）
TRIS（Euromedex，目录号：26-128-3094-B）
EDTA（Euromedex，目录号：E013）
SDS（Euromedex，目录号：EU0660）
NaCl（Euromedex，目录号：1112-A）
HCl（37％ACS试剂）（Sigma-Aldrich，目录号：258148-2.5ML）
苯基甲基磺酰氟（PMSF）（Euromedex，目录号：1111-C）
Hoescht 33258（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：H-3569）
不含甲醛甲醇（Polysciences，目录号：04018）
偶联异硫氰酸荧光素（FITC）（Clinisciences，目录号：FL-1031）的双歧杆菌凝集素
完成DMEM培养基（参见配方）
苯基甲基磺酰氟（PMSF）溶液（参见配方）
裂解缓冲液（见配方）

设备

37℃/5％CO 2细胞培养孵化器
6孔板
剪刀和镊子
玻璃均化器（Potter-Elvehjem PTFE，15ml）（Dutscher，目录号：057009和057021）
15 ml聚苯乙烯管
荧光显微镜

程序

制备人类包皮成纤维细胞在6孔板中培养将板HFFs细胞在完全DMEM培养基中并在CO 2存在下在37℃下培养4天。在染色之前，HFF在每个孔（8×10 5个细胞）中必须达到100％汇合。
HFF的染色
1. 用1ml 1x DPBS洗涤细胞培养物两次。
2. 修复细胞用1ml甲醛在2.5％在DPBS 1x稀释在4℃下20分钟。
3. 孵育20分钟，在黑暗中和在室温下，细胞用1ml的Hoescht稀释1/50,000在1x DPBS中。
4. 用1ml 1x DPBS洗涤细胞培养物两次。
5. 加入1ml 1x DPBS。
6. 在4℃保存，直到加入染色的均质脑。
  注意：染色的细胞在4℃下储存最多24小时。
从受感染的小鼠或大鼠中分离大脑
1. 麻醉动物与异氟醚和安乐死通过颈脱位。
2. 用70％（v/v）乙醇浸泡头部
3. 切开颅骨底部的皮肤，尽可能多地除去
4. 用剪刀切开头骨的背部和侧面部分，取下顶部
5. 收集脑组织在5ml DPBS 1x溶液。
大脑均匀化
将每只小鼠脑中的2毫升DPBS 1x放入玻璃匀浆器，匀浆在室温和调整终体积为4毫升。对于大鼠脑，在4ml中匀浆，并调整至8ml最终。
注意：大脑可以储存在4°C，直到染色不超过2天。
脑炎染色
1. 准备5 x裂解缓冲液和蛋白酶K 8 U/ml（库存800 U/ml，1/100稀释在5x裂解缓冲液在使用前）。
2. 对于小鼠，取1ml均质脑（1/4脑），加入398μl5x 裂解缓冲液，2μl蛋白酶K（参见步骤E1，因此最后浓度为0.008U/ml）和600μl1×DPBS（终体积为2μl） ml）对于大鼠，取2ml均质脑（1/4脑），加入995μl 的5×裂解缓冲液，5μl蛋白酶K（参见步骤E1，因此最终浓度为0.008U/ml）和2ml 1×DPBS（终体积为5μl） ml）。
3. 在56℃孵育15分钟，通过涡旋匀化每5分钟
4. 通过添加PMSF到最终，停止蛋白酶K活动浓度为2mM（200mM的原液），匀浆并在室温下孵育 5分钟。
5. 在1250×g（RT）下离心样品15分钟。
6. 轻轻吸取上清液。
7. 重悬于1ml用1/250英寸稀释的Dolichos biflorus凝集素 DPBS 1×（996μl1×DPBS +4μl的双岐菌凝集素）。
8. 在室温下放置在黑暗中的机械轮中孵育30分钟
9. 加入3ml DPBS 1x并均质以洗涤样品
10. 在1250×g（RT）下离心15分钟。
11. 轻轻吸取上清液。
12. 重悬每个样品在1毫升在DPBS 1x和转移到 Hoescht染色的HFFs（参见程序的A部分和B部分） ml /孔）注意：重要的是转移均质脑沉淀到HFF细胞上，以便在没有时显微镜聚焦或非常少的囊肿。
使用落射荧光显微镜（代表数据）计数囊肿
注意：样品可以在4℃下储存，直到显微镜观察不超过10天。要知道整个大脑的囊肿数量，将计数值乘以4。

代表数据

图1.来自未感染和感染的CBA小鼠的代表性囊肿，具有弓形虫寄生虫的脑。 i.p.后两个月。用1000个ΔKu80-ΔHXGPRT（PRU）速殖子感染CBA小鼠，收集脑，在4ml PBS中匀浆，并将1/4脑的每种悬浮液用于用D标记囊肿壁。并通过高含量筛选显微镜（Scan ^ R Olympus）进行分析。 A）CBA感染的小鼠脑的照片（4倍目标）。这个领域中存在三个染色的囊肿。 B）未感染的CBA小鼠脑（4倍目的），没有可见的囊肿，只有脑碎片。 C）从感染的CBA小鼠获得的染色囊肿的代表性组并通过（4x物镜）显微镜检测。囊肿被放大以检测潜在的假阳性，如在A6中。

食谱

完成DMEM培养基
10％（v/v）FBS
0.5％（v/v）青霉素/链霉素 2mM谷氨酰胺
苯基甲基磺酰氟（PMSF）溶液（储存浓度为200mM）将0.35g PMSF粉末溶于10ml异丙醇中储存于-20℃，1ml等份
注意：PMSF需要一些时间来解散。
裂解缓冲液（500ml） 10μMTRIS：2.5ml pH 8.0的2M TRIS（在250ml H 2 O中60g，调节pH）
1mM EDTA：2ml pH 8.0的250mM EDTA（在250ml H 2 O中23.27g，调节pH）
0.2％（w/v）SDS：5ml 20％（w/v）SDS 100mM NaCl（1.165g）高达500ml H 2 O v/v 注意：使用HCl 3 M（HCl 3 M：25ml HCl 37％加入到75ml H 2 SO 4中， em> O）。

致谢

这项工作由ANR授予Nu 05-MIIM-020-02和Nu 07-MIME-013-01，Lyonbiopole竞争力集群和法国寄生物学协会ParaFrap（ANR-11-LABX0024）支持。

参考文献

Aldebert，D.，Hypolite，M.，Cavailles，P.，Touquet，B.，Flori，P.，Loeuillet，C.and Cesbron-Delauw，M.F。开发高通量方法以量化弓形虫的囊肿。 Cytometry A 79（11）：952-958。
Cavailles，P.，Flori，P.，Papapietro，O.，Bisanz，C.，Lagrange，D.，Pilloux，L.，Massera，C.，Cristinelli，S.，Jublot，D.，Bastien， Loeuillet，C.，Aldebert，D.，Touquet，B.，Fournie，GJ和Cesbron-Delauw，MF（2014）。高度保守的Toxo1单倍型直接抵抗弓形体病和其相关的胱天蛋白酶-1依赖性杀死寄生虫和宿主巨噬细胞。 PLoS Pathog 10（4）：e1004005。