材料和试剂

小鼠胚胎干细胞（ES细胞）
200mM L-谷氨酰胺（100ml）（Life Technologies，Gibco ，目录号：320-5030AG）
甲基纤维素（STEMCELL Technologies，目录号：03134）
明胶（STEMCELL Technologies，目录号：07903）
转铁蛋白（人）（Boehringer-Mannheim）（Roche Diagnostics，目录号：652202）
MTG（Sigma-Aldrich，目录号：M6145）
血浆来源血清（PDS）（动物技术）特殊订单从公司。通常血清含有一些抑制分化的PDGF（必须叫公司，动物技术公司）
Epo（Amgen）（Thermo Fisher Scientific，目录号：50948385）
无蛋白的杂交瘤培养基II（PFHM-II）（Life Technologies，Gibco ，目录号：12040-077）
抗坏血酸
青霉素/链霉素（Pen/Strep）（Thermo Fisher Scientific，目录号：SV30010）
胎牛血清（FBS）
胎牛血清（FCS）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
胰蛋白酶
EDTA
NaHCO 3
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）
ES-IMDM（参见配方）
分化介质（参见配方）
次级分化培养基（参见配方）
Iscove改良的dulbecco培养基（IMDM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：12200-036,1L/pack）（参见Recipes）
纤维素酶（Sigma-Aldrich，目录号：C-1794）（参见Recipes）

设备

标准台式离心机
T25烧瓶
卡口管
孵化器
水浴
计量针
50ml Falcon管
0.22μm过滤器

程序

ES细胞的初级分化（制备类胚体）
1. 在建立分化之前两天，将细胞分裂成在糊化T25烧瓶中没有饲养细胞的ES-IMDM培养基（这稀释了大多数STO细胞）。每个T25烧瓶中加入4×10 5个ES细胞
2. 第二天更换培养基（ES细胞生长更快，因此使用更快的营养成分;每8小时增加一倍）
3. 设置差异如下。
  1. 从烧瓶中吸出培养基。
  2. 加入1ml胰蛋白酶/EDTA，涡旋，迅速除去
  3. 加入1毫升胰蛋白酶/EDTA，等待细胞开始分离。它通常需要约1-2分钟。不要过度胰蛋白酶消化细胞。
  4. 通过加入1毫升FCS（分化血清）和4毫升IMDM停止胰蛋白酶，吸移管向上和向下，使单细胞悬浮液。重要的是不要有细胞团。转移到15毫升卡通管。
  5. 以1,000 rpm离心5-10分钟。
  6. 将沉淀重悬在10ml IMDM（w/o FCS;这可以去除LIF和任何其他可能干扰分化的因素）。以1,000 rpm速度旋转细胞5-10分钟。
  7. 将沉淀重悬在5ml IMDM（w /分化血清）中，并使用伊红（0.2％曙红在1×PBS中）计数VIABLE ES细胞数。确保只计数ES细胞。
  8. 加入5,000-6,000个ES细胞/ml分化培养基，用于2.75-3EB。对于ChIP目的，我准备8-10盘和准备足够的媒体一个额外的菜。添加4,000-5,000个细胞/ml的第4-5天EB。加入500-2,000个细胞/ml，用于6-10天的EB。添加更多的细胞（7-8,000个细胞/ml，2.75-3 EB），如果他们分化差。太多的细胞可能导致EB的差的分化。你不想让细胞在达到某些日子之前用完营养。
  9. 通常在10ml/10cm培养皿中进行初级分化以得到EB。使用细菌培养皿（Valmark（好），Fisher（差）VWR（不推荐））。不要使用组织培养皿，因为所有的细胞将粘附，不会形成EB。如果你有办法不断地摇动你的菜在孵化器，这会提高效率，否则摇动你的菜，每天2-3次，直到EB准备好。
造血前体分析（二次分化）
1. 胚状体（EB）收获。
  1. 液体中的EB：将含有EB的介质转移到50ml管中。用IMDM和游泳池洗菜。使其在室温（RT）下静置约10-20分钟。 EB将沉降到管的底部。
  2. EB在甲基纤维素中：加入等体积的纤维素酶（2单位/ml，最终1单位/ml）并在37℃下孵育20分钟。收集EB在50ml管中。用IMDM洗菜。让它在室温下放置约5-10分钟。 EB将沉降到管的底部。
2. 当EB放置准备复制介质足够一个额外的板（如果你需要10板准备介质为11板）看细节的食谱。
3. 吸出尽可能多的媒体尽可能最小化EB损失，添加3毫升胰蛋白酶，并在37℃孵育3分钟（使用水浴）。非常重要的是保持时间。它与ES细胞的存活和分化潜能直接相关。如果你收获的FACS分析，7.5 mM EDTA应该用于解离的EB。这是更苛刻的治疗，但是，受体保持完好
4. 快速涡旋，加入1ml FCS（分化血清）
5. 通过用20号针头通过8-10次来解离。转移到15毫升管和旋转5-10分钟，在1000转。对较老的EB使用胶原酶（ >第9天）。当使用胶原酶时，在37℃孵育细胞1小时
6. 将沉淀重悬在0.3-1ml IMDM（w/10％FCS）中。体积越小越好。计数活细胞。在这一点上，应该没有细胞团块。
7. 将EB加入甲基纤维素复制培养基中。摇匀，让它坐几分钟，气泡起来。使用16号钝端针将培养基+ EB放在适当的培养皿上（可以使用任何细菌培养皿）。总是准备比你需要的更多。甲基纤维素是粘性的。
  1. 小规模分化：添加甲基纤维素复制培养基的3-6×10 4次EBs ml -1 -1次。加入1.25毫升甲基纤维素混合物到每个35毫米细菌盘用于胚芽集落测定。否则，每个添加1ml。为每个样品制备三个复制皿，即，制备4.5ml甲基纤维素复制培养基用于胚细胞集落测定，并制备4ml用于红细胞和其它骨髓集落测定的甲基纤维素复制培养基。
  2. 对于ChIP：加入1-1.5×10 5 EBs/ml的甲基纤维素复制培养基。向每个10cm培养皿中加入10ml甲基纤维素混合物。 10×10cm板将产生足够的用于4个IP（8-10×10 7个）的细胞。
8. 将板放置在245mm方形盘和小的35mm盘中用水保持湿度。这防止凝胶干燥和开裂。
收成
1. 制备纤维素酶+ PBS溶液（2μg/ml）
2. 向每个板中加入相同体积的纤维素酶溶液，使得细胞酶的最终浓度为1μg/ml
3. 在37℃下孵育30-40分钟，直到细胞水化
4. 刮板和收集细胞在50毫升Falcon管。涡旋并以1,000rpm旋转5分钟
5. 用新鲜培养基或PBS洗涤，并以1,000rpm，5分钟旋转

食谱

IMDM
对于1 L
1包IMDM粉
10ml /升Pen/Strep
3.024g/L NaHCO 3 3/
过滤通过0.22μm过滤器
如果使用预制液体介质 - 加入5.05ml P/S
ES-IMDM
这种媒体基本上与ES-DMEM相同，但使用IMDM（更丰富的媒体）而不是DMEM。用于明胶+ ES细胞培养。这用于明胶+ ES细胞和原代分化以产生EB
分化媒介
在IMDM中15％预选的FCS，具有以下
1％抗坏血酸（5 mg/ml）：每次设置分化时，使抗坏血酸新鲜。将抗坏血酸（5mg/ml）溶解在H 2 O中并过滤除菌（0.22μm）。
1％L-谷氨酰胺：一旦解冻，使用1周。
3μl/ml MTG（MTG通过向2ml IMDM中加入26μlMTG而稀释）。
纤维素酶
2U/ml在1×PBS过滤器中用0.45μm过滤器灭菌。

二级分化培养基（甲基纤维素混合物）a（所有％为v/v）

	红细胞	10个平板上有115毫升
甲基纤维素^b	44％	46 ml
PDS	10％	11.5 ml
抗坏血酸（5mg/ml）	0.25％	287微升
L-谷氨酰胺	1％	1.15 ml
转移酶	1％	1.15 ml
MTG（26μl每2ml）	3μl/ml	345μl
Epo	2单位/ml	5.75微升
PFHM-II ^d	5％	5.75 ml
IMDM	到100％	48.8 ml

如果EB电镀效率降低，请用新鲜的等分试样或批次替换以下一种或多种：PFHM II，IMDM，MTG，FBS。
预热甲基纤维素至37℃以降低粘度。在其已经解冻并在4℃储存> 1个月后丢弃。如果需要，甲基纤维素可以以6,000rpm离心10分钟以除去碎片（当旋转完成时转移到新的锥形）。 Methocell你从干细胞技术。是2.5％。计算结果为最终测定值为1.1％
在使用后立即关闭MTG和PFHM II盖以防止氧化。当打开一个新的50毫升的PFHM II等分试样，亚等分成五个10毫升等分试样，以防止氧化（覆盖锥形管用箔保护光）。
添加的各种因子包括bFGF（10ng/ml），激活素A（2-10ng/ml），BMP-2（2-10ng/ml）和BMP-4（2-10ng/ml）。对于>第6天EB加入KL（最终1％）和IL-3（最终1％）。 Feed的>在第6天（4-5ml/10cm培养皿）的第9天EB。用20％甲基纤维素代替44％制备相同的甲基纤维素鸡尾酒

致谢

该协议改编自Imem et al。，（2003）。这项工作的资金来自NIH。

参考文献

Zhang，W.J.，Chung，Y.S.，Eades，B.and Choi，K。（2003）。基因靶向策略，用于从分化的ES细胞分离造血和内皮前体。 em> Methods Enzymol 365：186-202
Im，H.，Park，C.，Feng，Q.，Johnson，K.D.，Kiekhaefer，C.M.，Choi，K.，Zhang，Y.and Bresnick，E.H。（2003）。在组织特异性染色质结构域内赖氨酸79甲基化的组蛋白H3的动态调节。 J Biol Chem 278（20）：18346-18352