材料和试剂

年轻的烟草植物（待测）
蒸馏水
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：I10010）
应力试剂（如NaCl，Sigma-Aldrich，目录号：S7653;盐度胁迫）
液氮
提取缓冲液（参见配方）

设备

叶冲床/软木钻（Sigma-Aldrich，目录号：Z165220）
培养皿（60×15mm）
微量离心管
纸巾
量筒
砂浆和杵（Sigma-Aldrich，目录号：Z112496）
玻璃比色杯（1ml）（Sigma-Aldrich，目录号：C8550-1EA）
电子天平
分光光度计
台式冷冻离心机（Eppendorf，目录号：5427R）
Vortexer（Sigma-Aldrich，目录号：Z755613-1EA）

程序

在充满正常排水良好的土壤的土盆中种植烟草幼苗，并在最佳条件（26±2℃，75％相对湿度，16/8h光照和黑暗的光周期）下将它们保持在温室中6周，。
选择相同高度和年龄的健康植物用于所有要测试叶片胁迫耐受性测定的品系
从每个植物收集叶子（从顶部第三至第五叶），轻轻地用蒸馏水洗涤以去除与组织相关的任何外来物质。
使用叶片打孔器或软木钻孔器切割叶以获得相似大小（1cm直径）和表面积的叶盘。避免从叶子的主静脉采集碟片。
将无菌蒸馏水上的每一行（具有背面表面向下）的叶盘（7-8）浮动成等份作为实验对照（图1，0天）。
在各种应力含有溶液（例如200mM NaCl）上，对于盐度胁迫（图1，0天，下图），从每条线（具有背面表面向下）漂浮相同数目的叶盘。
浮在特定溶液上的叶盘和实验对照应保持在相同的环境中，并且每12小时后可视化，直到观察到它们的"绿色"的视觉差异。
观察浮在对照溶液中的叶盘和应激溶液之间的明显差异，应拍摄照片（图1，3-4天后）。可以使用相同的方案（Kumar等人，2012; Singh等人，2012）测试叶盘的其它应力，例如氧化，渗透和重金属应力。。
通过如（Arnon，1949）所述提取叶圆片的总叶绿素并通过如所述的方法（Porra，2002）定量来定量该目视观察。
测量来自每个条件和品系的叶圆片的鲜重（克，gm）。
注意：在测量体重之前，用棉纸从盘上除去表面水分。
用研钵将叶片磨成细粉，用液氮研磨杵加入1ml提取缓冲液（80％丙酮），充分混合，立即将提取物转移到通风橱中的微量离心管（MCT）中。或者，将组织粉末添加到含有1ml提取缓冲液的管中。通过涡旋混合适当地混合1分钟，并在混合后在所有管中用提取缓冲液调节体积。
注意：在离心前用丙酮挥发，用萃取缓冲液将混合物的体积调节至1ml（如果必要）。
在寒冷条件（4℃）下将悬浮液以3,000×g离心5分钟。
将每个管的上清液转移到新的MCT管中，并使用该提取物测量吸光度
通过在800μl提取缓冲液中加入200μl上清液来稀释上清液五次。通过使用分光光度计和1ml玻璃试管将提取缓冲液（80％丙酮）作为空白，在664和647nm波长下一式三份测量该混合物的吸光度。
使用Porra（2002）描述的以下等式计算叶绿素A，叶绿素B和总叶绿素的含量。
叶绿素A = [{（12.25×A664） - （2.55×A647）}×DF]/TWμg/ml/g鲜重
叶绿素B = [{（20.31×A647） - （4.91×A664）}×DF] /TWμg/ml/g鲜重
总叶绿素=（叶绿素A +叶绿素B）μg/ml/g鲜重
这里，DF（稀释因子）=（吸光度溶液总体积（1ml）/稀释用上清液体积（200μl）
TW（组织重量）=所用组织的重量（克）
与其对照（0天）值相比，来自耐受品种的叶片将能够保持其总叶绿素水平，同时随时间具有最小损失。然而，敏感的叶片将显示它们的叶绿素水平（更多的应力诱导叶绿素漂白）响应于应激的急剧减少。

代表数据

图1.烟叶叶片在200mM NaCl存在下4天的应答。将叶片浮在水上作为实验对照，200mM NaCl用于盐胁迫。在控制条件下盘的"绿色度"没有变化，而盘在200mM NaCl的存在下漂白并变成黄色。

笔记

叶的大小和年龄是测定的重要因素。因此，请确保叶子是从相同的位置（从顶部第三到第五叶）收集，并且尺寸几乎相似，以避免不同行之间的初始差异。
所有溶液应在无菌水中制成，并在清洁工作台下工作，以避免任何类型的细菌或真菌感染
由于响应可以根据植物物种，植物年龄，施加的胁迫的类型和程度而变化，应定期监测实验至少7天（不严格地为4天）。如果在七天的时间内没有变化，新的实验应该设置有更大的压力
由于丙酮会降低一次性塑料比色杯，因此应使用玻璃比色杯

食谱

提取缓冲液（100ml）
丙酮：80 ml
H sub 2 O：20ml
准备在密封的玻璃棕色瓶中，每次准备新鲜

致谢

作者感谢国际遗传工程和生物技术中心（ICGEB），新德里，印度资助研究。

参考文献

Arnon，D.I。（1949）。分离的叶绿体中的铜酶。多酚氧化酶在植物生理中 24（1）：1-15。
Kumar，G.，Kushwaha，H. R.，Panjabi-Sabharwal，V.，Kumari，S.，Joshi，R.，Karan，R.，Mittal，S.，Pareek，S.L.和Pareek，集群金属硫蛋白基因在水稻中共调节，OsMT1e-P的异位表达赋予多种非生物胁迫耐受性在烟草中通过ROS清除。 BMC植物生物学 12：107
Porra，R.J。（2002）。用于准确测定叶绿素的联立方程的开发和使用的方格历史a 73（1-3）：149-156。
Singh，A.K.，Kumar，R.，Pareek，A.，Sopory，S.K.and Singla-Pareek，S.L。（2012）。含有CBS结构域的蛋白的过表达盐度，氧化性和重金属耐受性。转基因烟草中的抗氧化性，氧化性和重金属耐受性。