材料和试剂

稻米组织（根，芽，壳）（Muehe等人，2014）
液氮
65％HNO 3（Merck KGaA，目录号：100456）
双蒸水或MilliQ水
> 30％H 2 O 2（Merck KGaA，目录号：107298）< br />
85％磷酸（Merck KGaA，目录号：100563）
作为砷酸盐（Merck KGaA，目录号：106277）的储备溶液为0.05mol/L，稀释至适当浓度的作为砷酸盐的储备溶液（Merck KGaA，目录号：119773）为1,000mg /
NH 4 NO 3（Merck KGaA，目录号：102596）
用于LC-HPLC-ICP-MS的洗脱液A（参见配方）
用于LC-HPLC-ICP-MS的洗脱液B（参见配方）

设备

砂浆（直径至少10厘米）和杵（约15厘米长）
烘干炉（可调至60°C）
Whatman ^TM＃1滤纸（GE Healthcare，目录号：1440-125）
Duran 试管，直边（13×100mm）（Duran Group，目录号：261312）
聚乙烯法兰塞帽，管（天然）（Globe Scientific，目录号：118240）
使用涂有聚四氟乙烯（PTFE）的抹刀（Fisher Scientific，目录号：10081074），以尽量减少刮刀对植物材料的金属污染。
带玻璃塞的容量瓶（10ml）
管架
水浴
玻璃漏斗
电感耦合等离子体原子发射光谱法ICP-AES（CIROS）
电感耦合等离子体质谱ICP-MS（Agilent Technologies，型号：7700）
自动进样器样品瓶（8 mm，棕色玻璃，WICOM，样品瓶不含As）和带特氟龙隔膜的螺帽
配备有耦合到电感耦合等离子体质谱HPLC-ICP-MS（Agilent Technologies，型号：7700）的Shodex RSpak NN-614柱（150mm×6mm; Shodex）的液相色谱（Agilent Technologies，型号： />

程序

物料准备
将玻璃器皿（试管，容量瓶），研杵和研钵在1M HCl（戴手套和安全护目镜）中浸泡24小时，并在蒸馏水中洗涤三次，并在使用前干燥。这样做是为了去除吸附在设备上的金属污染物
植物材料的收获
1. 将水稻植物材料分成不同的组织（根，枝条，外壳和种子）使用干净的剪刀和镊子和佩带的手套。
2. 植物材料浸入蒸馏水中洗涤。
3. （大约1-5g鲜重）的组织在液体中研磨氮气使用研钵和研杵（3次，每次30秒，参见图 1）（磨碎的材料也可以储存在-80℃用于分子生物学分析）（Mueller等人，2013）。
4. 大约1g新鲜重量等分的液氮培植物材料放入开口的Falcon管中并立即在60℃的烘箱中干燥至少三天。
  
  图1.液氮 ₂ 地下水稻
米材料（戴手套和护目镜）中的总砷量化
1. 将20-70mg研磨和干燥的材料称重到Duran管中（确保植物材料不聚集）
2. 将2ml的65％HNO 3加入到植物材料中; 然后混合酸和植物材料通过轻轻摇动/涡旋管。
3. 杜兰管用塑料盖封闭。
4. 米材料在室温下消化过夜。
5. 将管放置在放置在水浴中的架子中。
6. 将该物质在100℃下煮沸2小时
7. 向管中加入2ml≥30％H 2 O 2 2。
8. 将米材料煮沸直到棕色气体停止生长。
9. 通过在实验室工作台上孵育1小时将样品冷却至室温
10. 如果提取物中没有更多的组织片，则材料完全消化
11. （如果植物材料没有完全消化（可见的小部分）透明组织），将提取物通过Whatman＃1过滤器过滤论文）。
12. 将提取物装入容量瓶中
13. Duran管用几毫升蒸馏水洗涤，然后将其加入容量瓶中的提取物中。
14. 用蒸馏水将提取物填充至10ml并在冷却和黑暗下储存，直到分析
15. 通过ICP-AES（浓度> 0.1mg/L）或通过ICP-MS检测较低浓度（检测限：0.2μg/L）。
米材料中的砷形态
1. 将20-50mg新鲜植物材料（根，芽和壳）切成 1cm长的片，并立即称重到Falcon管中抽样
2. 将10ml 10mM磷酸加入到植物材料中（Daus等人，2008）。
3. 通过在150rpm和室温下摇动将稻材料提取2小时。
4. 将材料通过Whatman＃1滤纸过滤
5. 为了防止As形态的变化，样品立即被填充进入自动进样器样品瓶。如果不可避免，样品可以存储在黑暗在低温（6℃）直到测量
6. 使用棕色玻璃自动进样器小瓶，用HPLC-ICP-MS分析砷酸盐和亚砷酸盐的氧化还原物种。
7. 此外，植物材料的干重通过在60℃干燥前后称量等分试样来估计
8. 新鲜植物材料中每种As种类的量计算每个干植物材料并且可以与总As相关材料的内容。
9. 关于使用该方案计算的As物种的代表性量，请参考Muehe等人（2014）。

笔记

种子也可以取样，但应该事先在研磨机中研磨。
在液氮中研磨样品材料确保材料的破坏和整个样品材料的充分混合，因此，当使用小样品等分试样进行进一步处理时，可进行无偏差分析。
将液体N 2 - 离子植物材料储存在-80℃下允许对材料进行分子分析。例如，在Muehe等人（2014）中，我们从这些样品中提取RNA并进行qPCR 对提取的RNA的cDNA产物
使用磷酸作为萃取剂产生材料中存在的总As的几乎完全回收。如果这些提取物中的As物种储存在阴凉和黑暗中，它们可稳定达4周（Daus等人，2006）。
关于ICP-AES和HPLC-ICP-MS的更详细的信息可以在Daus等人（2002），Daus等人，（2006），Daus （2008）和Noelte（2003）。

食谱

用于LC-HPLC-ICP-MS的洗脱液A/B 5mM HNO 3
用于LC-HPLC-ICP-MS的洗脱液B / 5mM HNO 3 + 50mM NH 4 NO 3（仅对于As（III）和As（V））7分钟等度94％A ]
流速：1ml/min，进样体积：50μl，LOD =0.2μg/L

致谢

这项工作由德国联邦环境基金会向EMM和德意志交易所（DFG）向AK（KA 1736/14-1）的奖学金计划提供资金。该程序先前用于Muehe等人（2014）。

参考文献

Daus，B.，Mattusch，J.，Wennrich，R。和Weiss，H。（2002）。关于富含铁的水样中砷物质的稳定性和保存的调查。 Talanta 58（1）：57-65。
Daus，B.，Mattusch，J.，Wennrich，R。和Weiss，H。（2008）。地下水中苯基砷的分析研究 Talanta 75 （2）：376-379。
Daus，B.，Weiss，H.，Mattusch，J。和Wennrich，R。（2006）。使用磷酸保存水样中的砷物种 - 限制和长期稳定性。 a> 69（2）：430-434。
Muehe，E.M.，Eisele，J.F.，Daus，B.，Kappler，A.，Harter，K.and Chaban，C。（2014）。是水稻（ Oryza sativa L.）磷酸盐转运蛋白和砷酸盐？ a comprehensive study。 Plant Mol Biol 85（3）：301-316。
Muller，K.，Daus，B.，Mattusch，J.，Vetterlein，D.，Merbach，I.and Wennrich，R。（2013）。砷对砷超累积剂锑的摄取和生物积累的影响 Pteris vittata < em>。 174：128-133。
Noelte，D。（2003）。 ICP Emission Spectrometry，Wiley-VCH，1 ^版。