材料和试剂

表达绿色荧光蛋白（GFP）或类似报告物（YFP，RFP，CFP，mCherry等）的拟南芥幼苗（5-6天龄）（Chalfie等人， 1994; Shaner et al。，，2007）
MilliQ水（H 2 O）
蔗糖（VWR International，目录号：27483.294）
Murashige和Skoog基础盐混合物（MS盐）（Duchefa Biochemie，目录号：M0221.0050）
2- [N-吗啉代]乙磺酸（MES）（Duchefa Biochemie，目录号：M1503.0100）
氢氧化钾（KOH）（Merck KGaA，目录号：1.05021.1000）
琼脂（LAB M，目录号：MC029）
乙醇（EtOH）（Sigma-Aldrich，目录号：32221-2.5L）
种子用乙醇灭菌（见配方）
½MS介质（参见配方）
生长条件（参见配方）

设备

生长室生长植物材料
方形板120×120×17mm（Greiner Bio-One GmbH，目录号：688102）
玻璃盖玻璃（VWR，Kammerdeckgläser，Lab-Tek ^TM，Nunc ^TM-eine kammer，目录号：734-2056）
反相共聚焦显微镜（Zeiss，型号：LSM 700）
注意：需要完全电动的X，Y，Z扫描级来执行多位置时间推移实验。
目标：20x [适合于监测侧根原基（LRP）起始的早期阶段，图2]，40x或60x（适于从阶段I向前监测LRP，图3）
用于GFP和其他荧光报道分子的荧光信号检测系统（Shaner等人，2007）

软件

操作共焦显微镜的软件
ImageJ（Abramoff等人，2004）
CellseT（Pound et al。，2012）
Microsoft Excel

程序

样品制备（图1）
1. 准备带盖的玻璃盖，用70％乙醇洗涤并干燥（图1A）。
2. 将45ml MS ^{+ 培养基倒入正方形板中，并等待直到它凝固（在室温下约40分钟;固体培养基应为2-3 mm薄）（图1B）。}
3. 使用带腔盖玻片切出固体MS介质块（图1C-D）。
4. 从介质块切下〜3mm宽的条（图1C-D）。
5. 使用带状介质润滑室内盖玻璃（图1E）。
6. 在室内转移10-15棵幼苗，单个幼苗的根不能重叠（图1F）
7. 用剩余的培养基覆盖幼苗（图1G）
8. 用带盖的玻璃盖关闭（图1H）。
  
  图1.样品制备。 A.盖好的盖玻璃。 B.固体MS ^{+ 培养基2-3mm薄。 C.用于切割块的盖玻片固体MS ⁺培养基。 D.小块MS ⁺媒体块被切断。 E. MS ⁺介质块用于润滑带腔盖玻片。 F. 10-15个拟南芥幼苗转移到室中。拟南芥幼苗用剩余的培养基覆盖。 H.闭上有盖的玻璃盖。}
实时共焦成像
1. 准备反向共聚焦显微镜使用[设置激光（GFP-488）; 目标 - 40x/1.20 W; 图像尺寸-x：114.09μm，y：114.09μm; zoom - 1.4; 扫描模式 - 平面，时间序列; 像素驻留 - 1.27μs; 主增益 - 652; 数字增益 - 1.5; 数字偏移 - 0.00; 针孔70 μm; 过滤器 - SP 555; 光束分离器 - MBS：MBS 405/488/555/639 DBS1： 492nm]。
  注意：参数将根据样本进行调整。
2. 安装室与幼苗。
3. 激活位置列表（LRP的标记位置列表）。
4. 在感兴趣的阶段找到LRP，并在中间平面处聚焦 LRP（邻近原基的木质部杆状链必须在焦点上，图2 和3，时间点0）。标记LRP的位置。移动到下一个LRP和重复该过程。要监测的LRP的最佳数量为〜20 实验。检查创始人细胞（FC）规范的过程和随后的发展阶段，我们建议手动弯曲根（Marhavy等人，2013），以标记根弯的位置，重点在两个木质部杆（图2），并使用物镜进行延时成像 20x。为了检查从I期起的LRP发展，我们建议使用物镜执行延时成像40x或60x（干，水或油浸）。
5. 激活时间系列。
6. 设置时间扫描间隔（通常为20至30分钟）。记住与增加LRP的数量超过30你必须增加间隔扫描。
7. 运行延时成像。通常，遵循LRP 器官发生从I期到IV期〜12〜16 h观察时间是必需的。（In拟南芥）LRP器官发生涉及八个发育阶段的特征在于高度协调的细胞模式分裂和分化。阶段I：两个周长创始细胞不对称地分裂形成由多达十个短线组成的原基初始细胞。阶段II：初始细胞分裂形成内层和外层。阶段III和IV：外层并且原始由三层组成（阶段 III）并且稍后内层经历类似的分割，使得四个细胞层是可见的（阶段IV）。阶段V至VIII：扩展和进一步划分四层最终导致出现的年轻侧根从母体组织（上覆组织的主根）。详情见Malamy和Benfey （1997）。
8. 处理图片以进行图像分析。出口共焦图像以tif或jpg格式; 在ImageJ中打开图像; 继续图像堆栈和另存为Avi格式。
共焦成像分析
1. 为了量化荧光报告信号ImageJ的强度可能用过的。导出并保存在TIF格式的共聚焦图片进行分析数据使用ImageJ。或者，或者，导入共焦堆栈 imageJ由BioFormats插件。在ImageJ中打开图像; 使用分段线（线的宽度相应调整）; 标记感兴趣的区域并使用函数"Mean"计算像素中的平均强度。复制结果"平均值"到Excel程序进行进一步处理。
2. 至确定荧光标记的膜蛋白的极性定位可以使用CellseT软件（Pound等人，2012）。软件是适合评估细胞和组织几何以及量化荧光标记信号的强度。按照CellseT instructions 进一步详情。
3. 评价LRP开发时间的动态连续系列图像可能会被处理为AVI文件（Windows媒体播放器或类似程序）。
  
  图2.实时分析使用DR5pro :: N7：Venus生长素报道子（Heisler等人，2005）建立起始细胞建立和LRP起始的早期阶段。累积在120分钟时在两个周围细胞中的核DR5pro :: N7：Venus信号。表示FC的建立（黄色箭头）。斜角分裂发生在240-480分钟之间，在发育阶段A产生LRP 由5个初始细胞（绿色箭头）组成。观察FC建立根在手动弯曲之前监测。目标20x用于观察。以分钟为单位的时间（右上角）是相对于根弯曲。红色星号表示两个木质部极。比例尺：40μm
  
  图3.使用生长素流出的LRP开发的实时分析（PIN1 :: PIN1-GFP ）的PIN1 :: PIN1-GFP 细胞膜（白色箭头），并从LRP表达第一阶段。在时间间隔400-480分钟内，LRP组成为5 初始细胞（粉红色箭头）经历周壁分裂（橙色箭头），并转入发育阶段II。时间（分钟）右边角）。红色星号标记两个木质部极。比例尺：30μm

食谱

种子用乙醇灭菌
1. 在2ml Eppendorf管中转移种子（每根管灭菌的种子的最大体积不应超过离底部3mm）。
2. 加入1ml 70％EtOH（工业级是足够的），摇动5秒，并留下种子沉淀10分钟
3. 除去70％EtOH。
4. 在干净的工作台下在100％EtOH中洗涤种子
5. 干种子在干净的长凳下。
½MS介质（1 L）
1. 加入10克蔗糖
2. 加入2.3克MS盐
3. 添加0.5 g MES
4. 将pH调节至5.9（KOH）
5. 加入8克琼脂（1000毫升瓶）
6. H 2 O
生长条件
1. 将拟南芥种子铺在填充有MS +培养基（45.5ml）的方板上。
2. 在4℃黑暗中分层2天
3. 幼苗在生长中在垂直取向的板上生长室在18或21℃的16-h光/8-h-暗光周期下。

致谢

我们感谢Matyas Fendrych的批评性阅读和评论。这项工作由欧洲研究理事会支持，起始独立研究资助（ERC-2007-Stg-207362-HCPO）和捷克科学基金会（GA13-39982S）给EvaBenková。该方案是基于先前发表的De Rybel等人（2010）和Laskowski等人（2008）的工作开发的。

参考文献

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