图1.测定试剂盒中的显色反应

材料和试剂

EnzChek焦磷酸测定试剂盒（Molecular Probes，目录号：E-6645）

组件A〜E的内容如下所示。

2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤核糖核苷（MESG）

嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）

20倍反应缓冲液：1.0mM Tris-HCl，20mM MgCl 2（pH7.5）

焦磷酸盐标准溶液：50mM Na 4 P 2 O 7

无机焦磷酸酶

1 M MgCl 2

100mM底物（表1中的实施例）

酶制剂（含或不含咪唑，见下文注5）

设备

块孵化器（ASTEC，型号：BI-516S）

分光光度计（Shimadzu，型号：UV-2600）

电子冷却和加热试管座（Shimadzu，型号：S-1700）

用盖子排空比杯杯

表1.底物试剂的例子

基板
公司
目录号码

三磷酸腺苷（ATP）
Sigma-Aldrich
A-2383

鸟苷三磷酸（GTP）
Sigma-Aldrich
G-8877

胞苷三磷酸（CTP）
Sigma-Aldrich
C-1506

尿苷三磷酸（UTP）
Sigma-Aldrich
U-6625

脱氧胸苷三磷酸（dTTP）
Sigma-Aldrich
T-0251

葡萄糖-1-磷酸（Glc-1P）
Sigma-Aldrich
G-9380

N-乙酰葡糖胺-1-磷酸（GlcNAc-1P）
Sigma-Aldrich
A-2142

半乳糖-1-磷酸（Gal-1P）
Sigma-Aldrich
G-0380

甘露糖-1-磷酸（Man-1P）
圣克鲁斯
生物技术
SC-284868

程序

测定酶活性

设置分光光度计和电子冷却和加热试管持有人持有持有人的比色杯以保持温度（通常为37℃） °C）

按照产品中的说明准备试剂盒解决方案手动将其保存在冰上。指令表示组件A 应在融化后4 h内使用。

根据表2制备反应混合物

将混合物在22℃预温育20分钟以反应污染的焦磷酸盐和磷酸盐在块培养箱中。我们通常在37℃下将混合物再孵育10分钟（测量）温度）加热混合物。原始说明推荐在22°C预温育10分钟。

放反应混合物在分光光度计中进入比色皿，并记录吸光度 360 nm以时间扫描模式进行5〜10 min。通常，线性时间颜色发展的过程通常是初始滞后时间 10〜20秒因此，每隔30〜60秒记录一次时间就足够了。

数据分析

测量吸光度变化率（ΔA<360 /秒）。

转换反应速度（ΔA360℃/秒）与速度（摩尔浓度/秒）之比最终的A< 360>之间的差异在正面对照和负控制1（见下面的公式）。

V（M/sec）=
360度（cm -1）/sec-ΔA360（cm -1）/sec（cm -1）阴性对照）

ε（M ^-1 cm ^-1）

我们通过实验来确定〜的摩尔消光系数基于最终吸收值，每次360nm，每次11,000（M ^-1 cm ^-1）积极的控制如下

ε（M ^-1 cm ^-1）=
最终A 360（cm ^-1，阳性对照） - 最终A 360（cm ^-1，阴性对照1）

焦磷酸盐浓度（M，阳性对照）

该试剂盒提供标准溶液50mM焦磷酸盐（组分 D）。我们手中虽然可以获得童话的可重现价值，原来没有提到已知的ε值文献（Upson等人，1996）在pH 7.6下表示ε（M ^-1 cm ^-1）= 11,000。

表2.反应混合物的制备

星号代表套件组件A〜E。 I〜IV：反应混合物的添加顺序。

代表数据

这里是从E表达和纯化的蓝细菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的代表性数据。大肠杆菌细胞（Maeda等人，2014）。图的初始斜率用于计算。我们通常使用50〜200nM的酶，底物[（d）NTP和糖-1P]在50μM〜2mM。

表3.在我们的例子中的反应混合物的制备
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图2.多组氨酸标记的蓝细菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的测量实例，其通过Ni-亲和层析纯化

笔记

在测量之前，必须检查试剂盒的反应能力。向试剂盒中加入50〜75μM焦磷酸钠，以确定试剂盒中焦磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的最大活性。我们不能测量高于试剂盒最大活性的NTP转移酶活性（图2）
要检查试剂盒的质量，我们必须首先测量阳性对照。
负对照2给出磷酸盐和焦磷酸盐的污染水平。阴性对照3和4分别提供背景酶活性以降解（d）NTP和糖-1P。样品溶液或底物试剂中的磷酸盐和焦磷酸盐增加了360nm处的背景吸光度。我们经历了一些试剂，如甘露糖-1-磷酸盐含有太多的磷酸盐。这些杂质可能取决于试剂或产品制造商的数量。
酶样品的简单代表性实例如图2所示。样品的斜率应在焦磷酸盐阳性对照和阴性对照之间。根据数据分析，使用曲线图的初始斜率进行计算。
咪唑（在测定混合物中达到最终100mM）对测定试剂盒活性几乎没有影响。这意味着试剂盒可以接受通过Ni-亲和层析纯化的His-标记的酶的常规制备。
锰离子（Mn ^{2 +}）抑制最终5mM或甚至更低浓度的测定试剂盒活性。
测量的重现性相当高，尽管套件的最大活动取决于套件的新鲜度。
根据试剂盒说明书，试剂盒的试剂在6个月至1年内稳定， -20°C。重组的MESG（组分A） -20°C至少一个月。重组嘌呤核苷磷酸化酶（组分B）可以在4℃下储存至少一个月。稀释的无机焦磷酸酶（组分E）可以在4℃下储存至少一周

致谢

这项工作得到MEXT和PRESTO科学研究资助项目的支持，这些科学研究由JST（到RN）和科学研究资助机构以及MEXT的GCOE计划"地球到地球"和来自MEXT的CREST JST（MI）。

参考文献

Enomoto，G.，Nomura，R.，Shimada，T.，Ni Ni，W.，Narikawa，R。和Ikeuchi，M。（2014）。蓝细菌色素SesA是一种二氢叶酸环化酶，其在热球感球菌中诱导细胞聚集。/a> J Biol Chem 289（36）：24801-9。
Kawano，Y.，Sekine，M。和Ihara，M。（2014）。蓝藻中UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的鉴定和表征 sp。 PCC 7120. Biosci Bioeng 117（5）：531-538。
Maeda，K.，Narikawa，R。和Ikeuchi，M。（2014）。 CugP是一种在蓝细菌中发现的新型无处不在的非GalU型细菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。 a> J Bacteriol 196（13）：2348-54。
Upson，R.H.，Haugland，R.P.，Malekzadeh，M.N。和Haugland，R.P。（1996）。测量产生无机焦磷酸盐的反应中的酶活性的分光光度法。 Anal Biochem 243（1）：41-45。