材料和试剂

胰蛋白胨（BD，目录号：211705）
蛋白胨＃3（BD，目录号：211693）
酵母提取物（BD，目录号：212720）
NaCl（Acros Organics，目录号：207790250）
右旋糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：D14-212）
胎牛血清（Atlanta Biologicals，目录号：S11150）
Tris碱（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP152）
Na 2 HPO 4（Sigma-Aldrich，目录号：S5136）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P-9333）
10x PBS（Corning，目录号：46-013-CM）
（Thermo Fisher Scientific，目录号：M35）
CaCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：C-4901）
EDTA-Na 2 O 2·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：E4884）。
D-生物素（Sigma-Aldrich，目录号：B4501）
S-NHS-LC-生物素（Thermo Fisher Scientific，目录号：21335）
Zwittergent 3-14（Fluka，目录号：40772）
蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：04693159001）
单体抗生物素蛋白磁珠，封闭缓冲液，再生缓冲液（Bioclone，目录号：MMI-101）
100％（w/v）TCA（Sigma-Aldrich，目录号：T0699）
丙酮（Thermo Fisher Scientific，目录号：A16F）
布鲁氏肉汤（见配方）
生物素化缓冲液（参见配方）
TNKCM（参见食谱）
裂解缓冲液（见配方）
TKE（参见食谱）
TKEZ（参见食谱）
样品稀释缓冲液（参见配方）
阻止缓冲区（参见配方）
再生缓冲区（参见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
洗脱缓冲液（参见配方）

设备

CO 2振荡培养箱（ATR Biotech，型号：AJ125B）
台式离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：75004381）
超声波仪（Thermo Fisher Scientific，目录号：FB505）
台式离心机（Eppendorf，目录号：5424）
超速离心机（Beckman Coulter，目录号：A94469）
Barnstead/Thermolyne Labquake Shaker Rotisserie（Labquake，目录号：C400110）
DynaMag ^TM - Spin Magnet（Life Technologies，目录号：12320D）

程序

细胞生物素化
1. 生长25ml的H。幽门螺杆菌液体培养物在含有10％胎牛血清，直至晚对数期（OD <600 = 0.7）。
2. 将来自25ml培养物的所有细菌以3,500×g在4℃下沉淀20分钟，并丢弃培养基。
3. 将细菌沉淀重悬在10ml生物素化缓冲液中
4. 在4℃下在3,500×g下沉淀细胞10分钟，并丢弃缓冲液。
5. 将细菌沉淀重悬在10ml生物素化缓冲液中
6. 加入S-NHS-LC-生物素至终浓度为200μM
7. 在冰上孵育30分钟。
8. 通过加入20ml TNKCM进行淬灭反应，在室温下孵育10分钟
9. 在4℃下将细胞以3,500×g离心20分钟，并丢弃缓冲液。
10. 将细菌沉淀重悬在10ml TNKCM中，在4℃下将细菌以3500×g离心10分钟，弃去缓冲液。重复两次以上的a 共三次洗涤。
细菌裂解和亚细胞分馏
1. 在3ml裂解缓冲液+蛋白酶抑制剂混合物中重悬细菌沉淀
2. 在冰上超声（4次，每次10秒，25％最大振幅）裂解细菌，以7,000×g离心10分钟沉淀完整细菌，收集裂解上清液
3. 通过在4℃下以40,000×g离心裂解物30分钟来沉淀膜。
4. 弃去上清液。
5. 用TKE冲洗膜沉淀三次。
6. 通过用干净的移液管尖端刮擦收集膜沉淀，并重悬于1ml TKEZ +蛋白酶抑制剂混合物中。
7. 在4℃下溶解1小时
8. 1 M Na-EDTA
9. 蔗糖（Merck KGaA，目录号：K45136551417）
10. 溶菌酶（N-乙酰甘露糖聚糖水解酶）（Roche Diagnostics，目录号：10837059001）
11. 提取缓冲液（参见配方）
设备
1. 50ml Falcon管
2. 500 ml离心管（可选）
3. 分光光度计（例如，PerkinElmer，型号：Lambda 25）
4. Sorvall GS-3转子离心机用于500 ml小瓶（可选）
5. SL 16R离心机（6×50ml）（例如Thermo Fisher Scientific）
6. 涡流
7. 超声波仪（如 Labsonic U，B. Braun Melsungen AG）
8. 轨道摇床（例如 Infors HT，Labotron）
9. 孵化器（例如 Certomat，B.Braun Melsungen AG）
10. 明视场显微镜（40x放大）
11. 37℃的水浴或恒温器测定叶绿素。
程序
1. 培养鱼腥藻 sp。 PCC 7120在没有组合氮的BG11 0培养基中。在我们的实验室中，将培养物在补充有10mM TES-KOH（pH 8.2）的BG11 0培养基中（PAR）和搅拌（约120RPM）的连续光强度下，在50μmol光子的连续光强度下30℃，以确保连续气体交换并保持在高CO 2（富含3％CO 2的空气）。
2. 在对数生长期（OD 750 = 1）中收获长丝。为了在叶绿素（Chl）获得10-30ml纯化的杂合体，15-20μg/ml的浓度使用约300-400ml的蓝藻培养物。
  注意：如Meeks和Castenholz（1971）所述，Chl的定量是基于90％甲醇中Chl a的消光系数78,74L/g/cm。
3. 在室温下以5,000xg离心细丝5-10分钟，弃去上清液。如果可用，使用离心机与转子配件500毫升管或分配培养到50毫升Falcon管，并进行几轮离心。在离心结束时，将所有细胞收集在一个50ml的falcon管中，并尽可能多地丢弃生长培养基。
4. 保持沉淀在猎鹰管，并添加提取缓冲液，直到约30毫升，彻底涡旋。
5. 加入30mg新鲜（！）溶菌酶到falcon管中，在37℃下在定轨振荡器（200RPM）上连续混合孵育1小时。
6. 在装有冰冷水的水浴中在40W超声处理1分钟，以避免过度加热。溶菌酶处理和超声处理将消化营养细胞，而异源细胞将保持完整。在该步骤之后，所有程序应在4℃和冰上进行。
7. 在1,000×g离心细胞悬浮液5分钟（4℃），弃去上清液（其可以用作营养细胞的粗蛋白提取物）。
8. 将沉淀重悬于10-15ml冰冷的提取缓冲液中，充分涡旋，250×g离心3分钟（4℃），弃去上清液。重复洗涤最少3次，或直到上清液不蓝色;含有异囊的残留球团应为浅绿色。
9. 通过显微镜检查杂合子的纯度。取少量的小球在玻片上（任选地重悬在少量的提取缓冲液中），并在显微镜下观察细胞（40倍放大）。颗粒必须主要由完整的圆形浅绿色杂合体的聚集体形成，在一些细胞中，氰甙的极性颗粒可能是可见的。 Alcian蓝染色也可用于确认制备中营养细胞的缺失（Maldener等人，2003）。
  
  注意：在显微镜下，营养细胞和杂合细胞可以容易地通过细胞的形状和颜色来区分。由于相机的功能，在这张照片细胞的颜色被修改。小箭头指向细丝中的异囊。
  注意：如果颗粒仍然含有由几个细胞组成的细丝，则溶菌酶处理不成功。在这种情况下，用新鲜酶重复溶菌酶处理，并继续进行超声处理。
10. 在液氮中冷冻沉淀并储存在-80℃下以便稍后用于蛋白质分离或重悬于提取缓冲液中以达到所需的Ch1a浓度，用于即时活性测量。冻结后异种细胞不保留活性。
食谱
1. 提取缓冲区
  50mM HEPES-NaOH（pH7.2） 0.4 M蔗糖 10mM NaCl 10 mM EDTA
致谢

该方案采用于Ermakova等人（2014），Fay（1980），Razquin等人（1996）和Ow等人（1996）（2009）。这项工作得到了芬兰学院（项目271832）和Kone基金会的支持。

参考文献
1. Ermakova，M.，Battchikova，N.，Richaud，P.，Leino，H.，Kosourov，S.，Isojarvi，J.，Peltier，G.，Flores，E.，Cournac，L.，Allahverdiyeva， Aro，EM（2014）。 Heterocyst特异性黄病毒蛋白Flv3B能够使丝状蓝细菌的鱼腥藻属生长繁殖。 > sp。 PCC 7120. Proc Natl Acad Sci U S A 111（30）：11205-11210。
2. Fay，P。（1980）。 Heterocyst隔离。方法in Enzymology 69 No.Cart：801-812。
3. Ow，S.Y.，Cardona，T.，Taton，A.，Magnuson，A.，Lindblad，P.，Stensjo，K.and Wright，来自Nostoc sp的富集杂合子的定量鸟枪法蛋白质组学。 PCC 7120使用8重等量异位肽标签。蛋白质组学 7（4）：1615-1628。
4. Razquin，P.，Fillat，M.F.，Schmitz，S.，Stricker，O.，Bohme，H.，Gomez-Moreno，C.and Peleato，M.L。（1996）。铁氧还蛋白-NADP +还原酶在来自鱼腥藻的异核中的表达生物化学316（Pt 1）：157-160。
5. Rippka，R.，Deruelles，J.，Waterbury，J.B.，Herdman，M。和Stanier，R.Y。（1979）。蓝藻菌纯培养物的通用分配，菌株历史和特性 J Gen Microbiol 111（1）：1-61。
6. Maldener，I.，Hannus，S。和Kammerer，M。（2003）。描述了蓝藻的五种突变体（Anabaena） sp菌株PCC 7120异核分化和转座子标记的基因的鉴定。 FEMS Microbiol Lett 224（2）：205-213。
7. Wolk，C.P。（1996）。 Heterocyst形成。 Annu Rev Genet 30：59-
8. Meeks，J.C。和Castenholz，R.W。（1971）。极端嗜热菌中的生长和光合作用，聚球藻（Cyanophyta）。 Arch Mikrobiol 78（1）：25-41。