材料和试剂

磷酸盐缓冲盐水片（Sigma-Aldrich，目录号：P4417-100TAB）
商业漂白溶液
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P5927）
Tris-base（DBH Prolabo，目录号：33621.260）
NaCl（Panreac Applichem，目录号：121659.1211）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：43819）
NP-40（IGEPAL CA-630）（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
氟化钠（NaF）（Fluka，目录号：71519）
NaOH（氢氧化钠颗粒）（Panreac，目录号：131687）
琼脂（Nzytech，Agar-agar，目录号：MB14801）
糖（商业）
苹果汁（商业）
Niapagine（Dutscher，Niapagine，目录号：789063）
完整的无EDTA蛋白酶抑制剂片剂（Roche Diagnostics，目录号：04693159001）
样品缓冲液（2x Laemmli样品缓冲液）（Sigma-Aldrich，目录号：S3401）
商业新鲜面包酵母膏
NB裂解缓冲液（参见配方）
1 M Tris-HCl（参见配方）
500 mM EDTA（见配方）
10％NP-40（见配方）
0.5 M NaF（参见配方）
1 M DTT（参见配方）
苹果汁盘（见配方）

设备

容器（暗盒提高与白色胚胎的对比度）
细胞过滤器（70μm尼龙细胞滤器）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352350）
1.5 ml管
1.5μl杵（Kimble Chase，目录号：749521-1590）
画笔号4
针（0.8×25mm）（Terumo，目录号：NN-2125R）
镊子（Fine Science Tools，Dumont＃5）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5424R）
飞笼
小培养皿（Sarstedt，目录号：83.1801.002）
过滤器（Acrodisc注射器过滤器0.2μmSupor膜）（Pall，目录号：PN 4612）

程序

用于从卵巢中提取蛋白质
1. 卵巢解剖
  1. 后女性沿着一小部分飞行（1:3）的男性在食品中补充新鲜的面包酵母膏一个到解剖前两天。这将刺激卵子发生和铅到更大的卵巢（随着晚期发育的数量增加阶段）。
  2. 通过断头灭活麻醉的苍蝇。
  3. 解剖技术（在立体镜下和使用解剖板和a 对镊子）：对于每次飞，放置在一滴1x PBS的生物并通过在水平处施加轻柔的压力将其保持在适当位置上胸部。使用镊子在自由手中轻轻地拖动下腹部（产卵区），直到角质层开始从飞行中分离，暴露内脏。分离卵巢从邻接的组织和器官，并将其转移到冰冷的1×PBS 同时解剖剩余的苍蝇（避免保持卵巢在 1x PBS溶液，时间长于30分钟）（见视频1 for a 视觉描述）。
    
    视频1.果蝇卵巢解剖
2. 通过样品匀浆的卵巢蛋白提取
  1. 将隔离的卵巢转移到含有200μl冰冷的NB裂解缓冲液的1.5ml管中
  2. 使用杵手动匀浆样品。均质化应该确保组织的完全破坏。如果要杵重复使用，在加工前用蒸馏水彻底清洗其他样品。
  3. 在约10,000 rcf（4℃）下离心20秒，以在管的底部沉降未处理的组织。
  4. 重复手动匀浆离心的材料。
  5. 在〜20,000rcf（4℃）下离心3分钟。
  6. 转移上清液到一个新的1.5毫升管，避免上脂质层。
  7. 重复该离心过程（步骤A2e-f）两次以上
  8. 定量蛋白质浓度并稀释至最终浓度（取决于下游应用的要求）。
  9. 用等体积的2x Laemmli样品缓冲液稀释终浓度
  10. 在100℃下加热样品5分钟，立即在-20℃下冷冻 °C后快速离心机下降。提取物可储存于-20°C 直到需要。
用于从胚胎中提取蛋白质
1. 胚胎收集和处理
  1. 前一到两天胚胎收集后面男性和女性飞行在收集笼子与标准苹果汁琼脂平板上补充新鲜面包酵母（图1A）。
  2. 开始收集通过将一个干净的苹果汁琼脂板在笼子上。让苍蝇在给定的时间间隔内产卵。
  3. 在进行产卵时，准备5个单独的容器用于胚胎的后续处理。容器与需要以下溶液：0.1％吐温20（在水中），50％商业漂白剂（在水中）和去离子水（3个容器）。放置a 收集篮（细胞过滤器）装入带有0.1％吐温20溶液（起始点）（图1A）
  4. 使用小画笔从琼脂板收集胚胎，并将其放置在部分浸没的篮子。
  5. 轻轻搅拌收集篮以洗涤胚胎。干燥基座的收集篮在纸组织中，然后转移到它后续容器。
  6. 转移胚胎在集合中篮子装入50％商业漂白溶液的容器中。孵育5分钟，温和，定期搅拌。这个的目的步骤（去氧化）是去除绒毛膜构成覆盖胚胎的蛋壳。 dechorionated胚胎将变得疏水并且将漂浮在漂白剂的表面上溶液（图1B）。
  7. 转移胚胎在集合中                             篮子用去离子水装入新容器。洗涤2分钟和                             重复两次使用每次新容器。开始洗涤前                             并且当在水容器之间转移时干燥的基部                             收集篮在纸巾中。
    注意：胚胎可以                                 在此步骤中通过将其转移至1.5ml管中（除去过量）                                 水），其在储存之前将在液氮中快速冷冻                                 -80℃。
    
    图1.设置胚胎蛋白提取                             收集笼与标准苹果汁琼脂板和溶液                             集装箱设置（A）。脱钙胚胎浮在表面                             漂白溶液（B）。手动选择收集在0.5毫升管中的胚胎                             盖（C1）。穿刺胚提取物（C2）。总提取物收集通过与Laemmli样品缓冲液（C3）混合。胚胎收集之前                              杵均质化（箭头1，D1）。胚胎可溶性蛋白                              提取物均质化和离心（箭头2，D2）。
2. 胚总蛋白提取物
  
  手动选择和针同质化协议
  1. 脱壳后，用锋利的镊子手动选择胚胎一个精细的画笔，并将它们转移到先前切片0.5毫升管盖（每个盖至少10个胚胎）（图1C1）。
  2. 通过用干的油漆刷吸收过量的水尽可能多地干燥胚胎。
  3. 使用针单独刺穿每个胚胎（图1C2）。
  4. 轻轻混合所得裂解物与10μl的1x Laemmli样品缓冲液（图1C3）。将溶液转移到1.5ml收集管。
    注意：Laemmli缓冲液样品的体积根据所使用的胚胎数量（每个胚胎1μl）。
  5. 在100℃下加热样品5分钟，立即在-20℃下冷冻 °C后快速离心机下降。提取物可储存于-20°C 直到需要。
  杵同质化方案
  1. 后脱壳，将胚胎（20μl体积）转移到1.5ml管中含有200μl冰冷的NB裂解缓冲液（图1D1）。
    注意：这将大致对应于最终的1至2μg/μl 蛋白质浓度。使用杵手工匀浆胚胎（〜10 笔画）。均质化应确保完全破碎组织。如果要重复使用杵，请先将其彻底清洗处理其他样品。
  2. 在约10,000 rcf（4℃）下离心20秒，以在管的底部沉降未处理的组织。
  3. 重复手动匀浆离心的材料。
  4. 在〜20,000rcf（4℃）离心3分钟。
  5. 转移上清液到一个新的1.5毫升管，避免上脂质层（图1D2）。
  6. 重复该离心过程（步骤B2 i-j）两次以上
  7. 定量蛋白质浓度并稀释至最终浓度（取决于下游应用的要求）。
  8. 用等体积的2x Laemmli样品缓冲液稀释终浓度
  9. 在100℃下加热样品5分钟，立即在-20℃下冷冻 °C后快速离心机下降。提取物可储存于-20°C 直到需要。

食谱

NB缓冲器

初始浓度	卷	最终浓度
1 M NaCl	7.5 ml	150mM NaCl
1 M Tris-HCl（pH 7.5）	2.5 ml	50mM Tris-HCl（pH7.5）
500mM EDTA（pH8.0）	200μl	2mM EDTA
10％NP-40	500微升	0.1％NP-40

将ddH 2 O加到最终体积为50ml的
中过滤灭菌（0.2μm过滤器）
制成10毫升等分试样并储存在-20°C
使用前加入10 ml的等分试样：10μl的1M DTT，200μl的0.5 M NaF，并溶解一个完整的无EDTA片剂到溶液中

1 M Tris-HCl（pH 7.5）
将157.6g Tris-HCl溶解于〜800ml ddH 2 O中
用NaOH调节pH至7.5 将ddH <2> O加入到最终体积为1000ml
过滤灭菌（0.2μm过滤器）
存储在RT
500mM EDTA（pH8.0）称量73.06g EDTA至〜400ml ddH 2 O 2 / 用NaOH缓慢调节pH至8.0 - 当pH接近8时，EDTA溶解。
将ddH 2 O加至最终体积为500ml
过滤灭菌（0.2μm过滤器）
存储在RT
10％NP-40
将10ml NP-40稀释至ddH 2 O，最终体积为100ml
过滤灭菌（0.2μm过滤器）
存储在RT
0.5 M NaF
在最终体积100ml中将2.0995g NaF溶解到ddH 2 O中。
过滤灭菌（0.2μm过滤器）
等分并储存在-20°C
1 M DTT
在通风橱中将1.5425g DTT溶解于ddH 2 O中，最终体积为10ml。
过滤灭菌（0.2μm过滤器）
等分并储存在-20°C
苹果汁盘（1升）
称量琼脂在一个大塑料烧杯中19.5克
加到琼脂 - 琼脂ddH 2 O 500ml
混合一切非常好
将烧杯置于微波直到沸腾
等待介质冷却至50°C，不时搅拌，以避免在表面上形成薄膜
在铝箔20克
中称重糖然后加入到溶解的琼脂中：糖，苹果汁250ml，Niapagin 10％5ml和ddH 2 O 250ml
1升苹果汁介质→100小板
将平板在4℃保存不超过30天

致谢

我们要感谢保罗纳瓦罗 - 科斯塔对手稿的批判性阅读，以及Rui Martinho为他的监督。资金：FCT-Fundaçaopara a Ciencia e Tecnologia（葡萄牙）：LeonardoGastónGuilgur，SFRH/BPD/47957/2008。资助者在研究设计，数据收集和解释或提交出版工作的决定方面没有任何作用。

参考文献

Guilgur，L.G.，Prudencio，P.，Sobral，D.，Liszekova，D.，Rosa，A.and Martinho，R.G。（2014）。在果蝇早期胚胎期间需要高效的前mRNA剪接的需求。 3：e02181。