材料和试剂

小鼠总胸腺细胞
BioMag山羊抗大鼠IgG（QIAGEN，50ml，目录号：310104）（QIAGEN，500ml目录号：310107）（1mg/ml）
大鼠抗小鼠CD4抗体（BD Biosciences/BD Pharmingen TM，目录号：553727）
大鼠抗小鼠CD8抗体（BD Biosciences/BD Pharmingen TM，目录号：553027）
BioMag暂停
胸腺细胞
注意：是否添加抗CD4抗体做耗尽或细胞分选是有争议的，因为一些研究人员声称DN人群的一小部分DN1表达低水平的CD4。

设备

磁性分离器（BD Biosciences/BD Pharmingen TM，目录号：552311，批次，目录号：0000038241）
注意：Qiagen还提供适用于不同容器的磁性分离器，如单管（目录号：36910），12管（目录号：36912），15ml/50ml管（目录号：36935）和烧瓶（目录号：36937）。

程序

计算
1. 为了获得最佳结果，使用尽可能稀释的细胞悬液。通常，以2×10 7总细胞/ml培养基制备总细胞。由于任何给定的细胞来源将具有独特的纯化要求，因此建议由个体用户确定最佳条件
2. QIAGEN建议每个细胞使用10-50个磁性颗粒（总细胞群）。然而，已经证明，每个总胸腺细胞少至2-3个磁性颗粒非常有效地工作。 1mg/ml BioMag悬浮液含有每毫克1×10 8磁性颗粒，相当于每毫升1×10 8磁性颗粒。因此，所需的BioMag悬浮液的体积是2.0-3.0ml每10 8个总胸腺细胞。
准备细胞悬液
1. 将浓度调节为2×10 7总细胞/ml无菌培养基。
一抗与细胞表面抗原结合
1. 向细胞中加入适量的一级抗体，并在4℃或冰上孵育30分钟。为了最大化抗原和抗体之间的结合，倒置管含有细胞和一抗每5分钟几次。为了获得最佳结果，个体研究者需要优化一级抗体的量。
清洗BioMag颗粒
1. 在结合过程中，在适当的无菌培养基或缓冲液中洗涤所需量的BioMag颗粒2-3次。首先，将Biomag颗粒悬浮在含有叠氮化钠的原始缓冲液中，并使用磁分离器（> 20兆欧斯）将磁性颗粒拉到管的侧面。小心地取出原始缓冲液以除去叠氮化钠防腐剂。使用磁选机进行分离2-3分钟。
2. 重复该程序用低蛋白（5％FCS）缓冲液建议减少非特异性结合重要：在洗涤步骤中不要离心BioMag悬浮液。离心导致大量聚集和丧失结合活性
从细胞中去除未结合的一抗
1. 在200-300×g离心5分钟，并吸上清液。将细胞重悬在无菌培养基中并在200-300×g离心5-10分钟以洗涤细胞。重复洗涤步骤1-2次，每次洗涤使用1ml无菌培养基。
BioMag颗粒结合一抗
1. 将细胞重悬于适当体积的无菌培养基中，并加入步骤3中制备的洗涤过的BioMag颗粒。无菌培养基和BioMag颗粒的最终体积应保持细胞在2×10 7/ml/ml。在4℃孵育15分钟。偶尔旋转反应容器，或在孵育期间将eppendorf管置于旋转的轮上。
注意：
1. 为获得最佳结果，总体积应≥1ml（包括BioMag悬浮液和细胞体积）。当使用体积<1ml时，应加入额外的培养基或缓冲液至最终体积为1ml。
2. 由于细胞表面随时间变化，磁性颗粒可能从靶细胞脱离，因此不推荐长时间孵育。
3. 室温（15-25°C）或37°C是某些细胞类型和QIAGEN的最佳选择。
4. 建议单独确定最佳细胞分选条件。
将靶细胞与其他不需要的细胞分离
1. 在4℃下将容器加入磁选机中10分钟。一旦分离完成，小心地移除上清液而不干扰沉淀到另一个管，上清液含有阴性选择后的靶细胞。
注意：
1. 清澈的上清液表明分离完成。
2. 分离必须在容器垂直放置的情况下进行，以便在烧瓶或管的侧面形成丸粒。这确保未选择的细胞不会污染磁性颗粒。
3. 为了获得最佳结果，请重复步骤7一次。作者强烈建议用至少15分钟的间隔重复步骤7一次，因为任何污染的磁性颗粒将干扰以下实验，特别是细胞分选。
计数靶细胞
1. 在200-300×g离心上清液5分钟以沉淀细胞，并将细胞重新悬浮在新鲜培养基中。计数以下实验的目标细胞的数量，并计算耗尽效率。

致谢

该协议改编自Wang等人（2009）。感谢Ying Zhao的技术援助，并感谢Sun实验室的成员的建议。这项工作得到了NIH的支持。

参考文献

Wang，H.C.，Perry，S.S.and Sun，X.H。（2009）。 Id1会削弱Notch信号，并通过提升Deltex1表达来削弱T细胞的承诺。 Mol Cell Biol 29（17）：4640-4652。