材料和试剂

用空载体（pMDC43）或携带CsMTP8的编码序列的载体pMDC43转化的拟南芥生态型哥伦比亚（ Col-0 基因在35S CaM启动子（<35S :: CsMTP8 ）下
96％乙醇
5％次氯酸钠（NaClO）（由Procter and Gamble生产的商业洗涤剂ACE）
无菌水
1 M KOH（用于pH建立）
Murashige& Skoog基础培养基（MS）（Sigma-Aldrich，目录号：M5519）
Phytagel（Sigma-Aldrich，目录号：P8169）
介质制备盐：
（POCH，目录号：874582797）。
MgSO 4 .7H 2 O（POCH，目录号：613780111）。

（POCH，目录号：742020112）
HPO <4>（POCH，目录号：742100117）
HNO <3>（POCH，目录号：5296041）
KNO ₃（POCH，目录号：738910115）

O（POCH，目录号：902840115）

（POCH，波兰，目录号：616940119）。

（POCH，目录号：531360115）（POCH，目录号：ACRS42361）
（POCH，目录号：Ph.Eur.6-265762730）
（NH 4）6 Mo 7+ O 24+。在本发明的一个实施方案中， O（POCH，目录号：139000115）
（BioShop，目录号：OM19432）的缓冲液洗涤
用于在板上种植植物的中等组成（参见配方）
用于在液体溶液中生长植物的中等组成（参见配方）
10mM Na 2 EDTA（参见Recipes）
65％HNO ₃（见配方）

设备

方形（120×120mm）培养皿聚苯乙烯无菌
生长室或植物光酮（白天期间在250μmol·m -2 -2℃/s和<23℃下的16/8小时光周期和夜间22℃）
通风橱
层流柜
高压灭菌器
振动器
镊子
管1.5 ml（Axygen）
具有封闭容器的加热消化器（矿化器）（Kiejdal Digestion Unit DK-20，VELP Scientifica，目录号：F30100350）
原子吸收分光光度计（Perkin Elmer，型号：AAS 3300）
图像捕获设备（常规数码单反单反相机，如 Nikon D40相机）
精密平衡（±0.0001）

A的生长测试。 thaliana 植物中的锰过量

分层后，将具有种子的碟转移至培养室或植物甾醇（22℃，16/8h光照/黑暗）光周期），并在垂直位置生长16天（图2A-B）。然后，使用Nikon D40照相机捕获植物图像测量植物的重量。实验重复三次次，每次处理重复三次。

图2。 Mn过量对线的增长的测量效应的例子拟南芥用空载体或载有 2014）。植物在对照0.5MS（A）或补充0.5MS中生长与2mM MnSO 4（B）在植物甾醇中培养16天（22℃，16/8小时亮/暗光周期）。
测量植物鲜重。整个16日龄植物生长在MS培养基或MS培养基中补充使用镊子从培养皿中收集2mM MnSO 4 使用精密天平称重（图3A-B）。除了估计的植物重量，可以在该测定中评估其它表型，例如根长度，叶数和面积或叶绿素量。使用学生t检验和ANOVA（Excel）（P <0.05）（图3C）对获得的数据进行统计分析。

图3.植物鲜重的估计。16天龄的植物小心地从培养皿中取出并用精密天平称重（A-B）。数据表示为平均值±三的标准偏差每个至少30株植物的独立实验（C）。不同的字母表明控制和胁迫条件之间的显着差异（a）或用空载体转化的线和两条线之间携带CsMTP8（b）（P <0.05; ANOVA Student-t检验）。

植物中锰积累的测量

为了评估植物中的Mn积累，16天龄植物生长将含有对照0.5MS的陪替氏培养皿小心地转移入（Morel等人，2009）的液体培养基，补充或不补充50μMMnSO 4并进一步生长5天（图4A-B）。简言之，用棉花轻轻包裹5株植物羊毛并置于含15-ml Falcon的液体培养基中。五后天，小心收获植物，在10mM Na 2 EDTA中洗涤（在Na 2 EDTA溶液中在台上孵育5分钟，图4C）和在50℃下干燥。

图4.植物准备的细节测量Mn积累。仔细采集16天的植物（A），并转移到用铝箔（B;每个Falcon 5植物）覆盖的15-ml Falcon中，所述培养基含有液体培养基（Morel等人，2009）。植物甾醇5天后，将植物在10mM Na 2 EDTA（C）中洗涤5分钟并干燥
干燥的植物从补充或不补充的液体培养基收集 MnSO 4在研钵中用杵研磨成粉末。
100 mg 将研磨的组织放置在玻璃容器中（图5A），然后在室温下用10ml浓缩（65％）HNO 3消化过夜温度下通风橱。
之后，植物样品在通风橱中在150℃下在相同溶液中煮沸12小时（图5A）。然后通过原子吸收分析该溶液使用Perkin Elmer A3300分光光度法（图5B）。这是一个装备有阳离子灯的多元件分光光度计（例如Mn 灯）。具有金属的样品被雾化然后吸收由灯发射的特定波长。然而，通过原子吸收光谱法的元素分析提供可靠和可重复的结果时的浓度金属在样品中相对较高（高于在自然界遇到的条件）。
使用学生的测试和ANOVA（Excel）（P <0.05）（图5C）对所获得的数据进行统计分析。

图5.拟南芥植物中Mn积累分析的细节。A.干燥的植物在封闭的玻璃容器中通过加热消化在10ml 65％HNO 3中的加热消化器中在150℃下加热12小时。 B.原子使用吸收分光光度计估计Mn含量溶液（矿化）。 C.示例数据为作为三次独立实验的平均值±标准偏差每个至少有15株植物。星号表示显着差异（b）（P <0.05; ANOVA学生t检验）的两条线之间的差异。

食谱

板材上生长植物的中等组成
1. 对于1L的0.5MS对照培养基
  2.2g Murashige& Skoog（MS）介质
  用KOH调节pH至5.7 加入5克琼脂
  使用高压灭菌器在121℃/1atm下灭菌20分钟
2. 对于补充有2mM MnSO 4·7H 2 O的1个平板的培养基MS 将1ml 100mM MnSO 4溶液加入50ml培养基中

用于在液体溶液中生长植物的培养基组合物

对于1L对照培养基
宏元素：

Ca（NO 3）2 sub 2 4H 2 O	189 mg/L
MgSO 4。。 O	270 mg/L
KH ₂ PO ₄	100 mg/L
K _{2 HPO ₄}	10 mg/L
KNO ₃	200 mg/L

微元件：

FeSO 4 ^。 7H <2> O	5.54 mg/L
MnSO 4 ^。 5H sub 2 O	0.59 mg/L
H ₃ BO ₃	0.56 mg/L
CuSO 4 ^。 5H sub 2 O	0.195 mg/L
ZnSO 4 。 7H O	0.86 mg/L
（NH 4）6 Mo 7+ O 24+。在本发明的一个实施方案中， O	0.092mg/L
Na EDTA ^。 2H 2	7.44 mg/L

对于1L补充有50μMMnSO 4
的培养基将0.5ml 100mM MnSO 4溶液加入到培养基中

10mM Na 2 EDTA 3.722g乙二胺四乙酸二钠-2H 2 O（Na 2 EDTA），2H 2 O，Mw = 372.24）为加入到800ml双蒸水H 2 O中并剧烈搅拌用NaOH将pH调节至8.0，用双蒸水
将溶液的体积调节至1L 通过高压灭菌将溶液灭菌
65％HNO 3
65％HNO 3作为即用型浓缩溶液购买

致谢

我们衷心感谢Sophie Filleur博士和SébastienThomine博士（法国国家科学技术中心（ISV），法国Gif-sur-Yvette中心），让我们有机会变换。 thaliana 植物。这项工作得到了波兰科学和高等教育部的支持（授权号IP2010 026470）。该协议改编自Migocka等人（2014）。

参考文献

Migocka，M.，Papierniak，A.，Maciaszczyk-Dziubinska，E.，Pozdzik，P.，Posyniak，E.，Garbiec，A.and Filleur，S。（2014）。黄瓜金属转运蛋白MTP8在酵母中表达时赋予锰增加的耐受性，并且 Arabidopsis thaliana 。 65（18）：5367-5384。
Morel，M.，Crouzet，J.，Gravot，A.，Auroy，P.，Leonhardt，N.，Vavasseur，A.and Richaud，P.（2009）。 AtHMA3，一种允许Cd/Zn/Co/Pb液泡储存在拟南芥中的P1B-ATP酶。植物生理学 149（2）：894-904。