材料和试剂

植物材料：拟南芥生态型Columbia-0（野生型）获自俄亥俄州立大学（哥伦布）的ABRC
甘氨酸N- [4- [6 - [（乙酰氧基）甲氧基] -2,7-二氯-3-氧代-3H-呫吨-9-基] -2- [2- [2- [双[2- [ （乙酰氧基）甲氧基] -2-氧乙基]氨基] -5-甲基苯氧基]乙氧基]苯基] -N- [2 - [（乙酰氧基）甲氧基] -2-氧乙基] - ，（乙酰氧基）甲酯（Fluo- AM）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：F-14218）}
氯化钾（KCl）（Sangon Biotech，目录号：PB0440）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sangon Biotech，目录号：C0556）
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（游离酸，一水合物）（Sigma-Aldrich，目录号：M3671）
氢氧化钾（KOH）（Sangon Biotech，目录号：PT1159）
乙酸，乙二醇四乙酸四乙酸（EGTA）（Sangon Biotech，目录号：ED007）
氯仿（国药化学试剂，目录号：10006818）
次氯酸钠溶液（Sangon Biotech，目录号：S1944）
琼脂（Sangon Biotech，目录号：AJ637）
Murashige＆amp; Skoog（MS）基础培养基维生素（ Phyto 技术实验室^{®，目录号：M519）}
脱落酸（ABA）（Sigma-Aldrich，目录号：A1049）
磷脂酸（PA）（Avanti Polar Lipid，目录号：840858C）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
无水乙醇（Sangon Biotech，目录号：ET0737）
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）（Sigma-Aldrich，目录号：252859）
表皮缓冲液（见配方）
Fluo-3 AM储备溶液（见配方）
加载缓冲区（见配方）
ABA储备溶液（参见食谱）
ABA工作解决方案（见配方）
PA工作解决方案（见配方）

设备

刻度离心管（1.5 ml）
培养皿（直径6厘米）
覆盖玻璃（20mm×20mm，厚度0.13-0.17μm）
幻灯片（76 mm * 26 mm，1-2 mm厚）
镊子
移液器和匹配的提示
生长室（Percival，型号：I-41LL）
蔡司LSM780共焦激光扫描显微镜
微处理器pH计（HANNA ^{®仪器，型号：HI-2211）}
超声波破碎机（Scientz，型号：JY92Ⅱ）

软件

蔡司共焦软件ZEN 2012（蓝版）
Microsoft Excel

程序

样品制备
1. 将拟南芥的种子通过浸泡在75％乙醇3分钟和2％次氯酸钠10分钟。种子是用无菌蒸馏水洗涤3至5次，然后进行洗涤置于MS培养基（1％琼脂）上。将拟南芥种植在a中生长室为160μmol/ m 2 / s光强度和14/10h（24/21℃）日夜制度。从7日龄幼苗的子叶上切下来植物用于实验。
2. 子叶是与表皮缓冲液在生长室（160℃）中于24℃孵育2小时 μmol/ m 2 / s光强度）以诱导各种气孔开放治疗。
3. 然后将样品在10μM氟-3AM中孵育加载缓冲液（从10mM MES-KOH pH的5mM储备溶液中稀释 6.1）在4℃下在黑暗中2小时。较高浓度的fluo-3 AM在孵化的室温可能导致假阳性信号来自其他离子，例如Mn 2 + ，Zn 2 + 和Pb 2 + 。
4. 样品用加载缓冲液冲洗3次以除去fluo-3AM并进行在ABA或PA加入前，保持在生长室（24℃）中1小时。
5. 对于ABA或PA处理，子叶与10μMABA孵育或50μMPA工作溶液，并通过共焦激光观察扫描显微镜。
[Ca 2 + ] > cyt 成像
1. 使用488nm激发和510-545nm激光进行[Ca 2 + ] cyt 成像发射滤波器记录[Ca 2 + ] cyt 图像。在ABA或PA添加后发生[Ca 2 + ] cyt 的增加。 Fluo-3染料的荧光强度当与细胞质中的[Ca 2 + ]结合时增加。 Fluo-3的Kd 钙是325nM。 Fluo-3还可以检测叶绿体附近的钙膜和质膜，并在细胞质中显示更高的荧光因为钙浓度较高。 [Ca 2 + ] cyt 变化以彩色条指示的虚拟色调可视化。彩条显示像素强度为箭头所示（图1）
2. 成像参数如下：Plan-Apochromat 10×/ 0.45 M27 客观，图像尺寸1,024 x 1,024，针孔3通风单元，扫描速度1936.28 ms。在指定的时间拍摄图像。使用保护细胞中的荧光像素强度值进行测量蔡司共焦软件ZEN 2012（蓝版）。像素减法的背景强度值约为4.5 请请注意，激光功率，增益，偏移，变焦，扫描速度等如果使用强度，不能在实验条件下改变区分表型将值设置在最亮的样本并继续在相同条件下进行成像以获得适当的数据集。如果荧光足够高，可以用荧光进行范围。共焦扫描将更加敏感和可重复

代表性资料

图1：拟南芥中ABA和PA诱导的细胞质钙的保护细胞保守细胞在（A）之前或用10μMABA（B）或50μMPA（C）处理12分钟后，通过荧光-3AM染料监测保卫细胞中的cyt 。彩条显示强度如箭头所示。 D.在ABA或PA-处理的保卫细胞中[Ca 2+ / 2]亚细胞的相对水平的变化。用于测量强度的兴趣区域由背景扣除的白色矩形表示。值是来自三个独立实验的平均值±SD（不少于10个子叶的50-60）。

食谱

表皮缓冲液
10 mM KCl
0.2mM CaCl 2
0.1 mM EGTA
10 mM MES-KOH
用KOH（0.1M）
调节pH至6.15
Fluo-3 AM库存解决方案
5 mM Fluo-3 AM in DMSO
Fluo-3 AM加载缓冲区
10 mM MES
用KOH（0.1M）
调节pH至6.1 10μMFluo-3 AM
ABA库存解决方案
将26.432 mg ABA粉末溶解在1 ml乙醇中，浓度为100 mM
ABA工作解决方案（治疗）
将ABA储备溶液（10,000x）加入到表皮缓冲液中至浓度为10μMABA
PA工作方案（待处理）
PA在氯仿中在N 2下干燥，并通过超声处理悬浮于1ml表皮溶液中以制备储备溶液（50mM，1,000x）。 PA处理前用表皮溶液将PA储备溶液稀释至50μM

致谢

这些方法从（Jiang等人，2014年）改编而来。所有引用的参考文献也改编了技术。这项工作得到了中国国家基础研究计划（31100194和31470364）以及中央大学基础研究基金（KYZ201423）给Q张的资助。

参考文献

Allen，G.J.，Kwak，J.M.，Chu，S.P.，Llopis，J.，Tsien，R.Y.，Harper，J.F.and Schroeder，J.I。（1999）。 Cameleon钙指示剂报告拟南芥保卫细胞中的细胞质钙动力学。 a>植物J 19（6）：735-747。
Jiang，Y.，Wu，K.，Lin，F.，Qu，Y.，Liu，X. and Zhang，Q.（2014）。磷脂酸将钙信号传导和微管动力学整合到调节ABA诱导的拟南芥气孔闭合中/ ;。 Planta 239（3）：565-575。
Krebs，M.，Held，K.，Binder，A.，Hashimoto，K.，Den Herder，G.，Parniske，M.，Kudla，J.and Schumacher，K。（2012）。基于FRET的遗传编码传感器允许Ca（2）（+）的高分辨率活细胞成像动植物。植物J 69（1）：181-192。