材料和试剂

3周龄拟南芥植物
液氮
丙酮（HPLC级）（Wako Chemicals USA，目录号：014-08681）
甲醇（HPLC级）（Wako Chemicals USA，目录号：134-14523）
氮气
EN1-16（TAITEC，目录号：0076417-000）
甲酸（HPLC级）（Wako Chemicals USA，目录号：063-04192）
利多卡因（麻醉剂）m/z 235.18104（Wako Chemicals USA，目录号：120-02691）
丙氯灵（农药）m/z 376.03863（Wako Chemicals USA，目录号：164-25131）
利血平（生物碱镇静药）m/z 609.28121（Wako Chemicals USA，目录号：184-00691）
铃蟾肽（肽）m/z 810.41479（Wako Chemicals USA，目录号：339-40861）
28〜30％氨溶液（Wako Chemicals USA，目录号：016-03146）
阴模内标：2.4-D（植物激素）m/z 218.96157（Wako Chemicals USA，目录号：040-18532）
氨苄青霉素（抗生素）m/z 348.10180（Wako Chemicals USA，目录号：017-20531，CHAPS 8去污剂）m/z 613.388865（Wako Chemicals USA，目录号：341-04721）
四-N，N-乙酰基壳四糖[（GluNAc）4] m/z 829.32023（Tokyo Chemical Industry，目录号：T2910）
50％（v/v）乙腈（HPLC级）（Wako Chemicals USA，目录号：018-19853）[使用蒸馏水稀释乙腈至50％（v /
乙酸（Wako Chemicals USA，目录号：014-20063）
28〜30％氨溶液（Wako Chemicals USA，目录号：016-03146）
超纯水（推荐但不需要）

设备

配有7特斯拉主动屏蔽超导磁体（Agilent，Ionspec）的IonSpec Explorer FT-ICR/MS。
玻璃瓶和特氟隆盖（GL Biochem，目录号：1030-46716）
玻璃吸管
0.45μm过滤器（PTFE）（ADVANTEC ，目录号：13HP045AN）
热块

程序

用于FT-ICR/MS分析的样品制备
1. 用液氮匀化样品，用研钵和杵制成整株植物的粉末样品
2. 溶于萃取溶剂至20％鲜重/体积。二萃取溶剂，100％丙酮和100％甲醇洗脱各种极性化合物
3. 通过0.45μm过滤器（PTFE）过滤提取的样品溶液
4. 将过滤的样品溶液转移到小瓶中
5. 转移1毫升样品溶液到一个单独的小瓶。放置样品溶液进入通风室并使用氮气 EN1-16。在40°C时，溶剂会通过加热块蒸发。
6. 将样品溶解在50％乙腈（0.1〜1ml，取决于样品品种），并存储在-80℃。
7. 在ESI分析前稀释样品1:14。
FT-ICR/MS分析
1. 使用IonSpec Explorer FT-ICR/MS进行质谱分析和负离子化操作模式。离子由ESI产生源用0.005英寸i的熔融石英针。 d。（Oikawa等人， 2006）。使用哈佛注射器泵模式22在a注入样品流速通过100μlHamilton注射器为0.5至1.0μl/min。组电喷雾发射器的电势为3.0kV和-0.3kV 正和负电喷雾。
2. 对于正模式，向提取的样品溶液中加入99.5％甲酸（步骤 A7），终浓度为0.1％（v/v）。正模式内部标准：利多卡因（麻醉剂）m/z 235.18104，丙氯灵（农业化学品）m/z 376.03863，利血平（生物碱镇静剂药物）m/z 609.28121，铃蟾肽（肽）m/z 810.41479。
3. 对于阴性模式，向萃取的样品溶液中加入28〜30％氨水溶液，最终浓度为0.1％（v/v）。
  阴性模式内标：2.4-D（植物激素）m/z 218.96157，氨苄青霉素（抗生素）m/z 348.10180，CHAPS 8去垢剂）m/z 613.388865，（GluNAc）4 m/z 829.32023
4. 质谱通过 100-1,000m/z范围，并累积以提高S/N比。时间累积的时间取决于总离子浓度。分析峰使用IonSpec Omega ver.8软件。每个峰的校对m/z 参考内部标准。测量产物离子质量每个样品的光谱三次。
5. 当检测到离子峰时在三个连续光谱扫描中至少两次，它们是作为离子信号从实际进行进一步的数据处理分析物。
6. 共有四个质谱峰来自两个不同的萃取溶剂（甲醇和丙酮）和两次离子化操作模式（正和负）使用我们的内部对齐 Java程序。（如果你对这个内部Java程序感兴趣，请联系Ohta教授。）
数据规范化
对数据应用全局规范化。为了避免零分割，缺失值用10 ⁵填充作为FT-ICR/MS的背景信号。使用10的因子的对数标度转换峰强度。使用四个数据矩阵应用全局正规化。
全局归一化计算方法如下：
1. 平均强度是通过将总信号除以每个光谱中检测到的峰的数目来计算的。
2. 对每个洗脱和电荷对中的所有光谱计算平均信号。
3. 通过除以每个光谱计算归一化因子每个光谱的平均强度乘以总平均强度
4. 归一化强度通过将原始强度乘以每个光谱由先前计算的归一化因子。经验公式通过FT-ICR/MS的准确性推断。因为样品离子变为加合离子以附着质子和钠离子，等。我们假设涉及到以下检测到的峰[M + H] +，[M + Na] +，[M + K] +，[M + H + [M +铵] +，在正电离模式中，[M-H] - 为负电离模式。
5. 使用KEGG搜索候选化合物（ http://www.genome.jp/kegg/），NIST（ http://webbook.nist.gov/chemistry/）和KNApSAck（Shinbo等人，2006）。

笔记

为了获得可靠的可再现数据，必须使植物生长环境尽可能均匀/一致。例如，根据光环境，植物叶绿素荧光的值将波动。植物在靠近生长培养箱上的侧灯时接收的光的量与在搁架的中心上接收的光完全不同。由于这个原因，重要的是洗牌生长板的位置，等等。
重要的是FT-ICRMS保持稳定的真空。我们还必须小心ESI喷嘴末端的样品锥的尺寸。同样重要的是，在必要时对ESI离子喷射的方向进行微小调整，以尽可能多地捕获离子进入ICR细胞。
当植物提取样品的浓度过高时，或当样品中包含其他不需要的物质时，FT-ICRMS可能会有问题。需要定期烘焙并从室内壁除去离子以及清洁离子源。

致谢

这项工作得到教育，文化，体育，科学和技术部（日本）[科学研究助理（No.17681022至R.M.）]的支持。
FT-ICR/MS（IonSpec）机器属于大阪府立大学，对于该项目，根据同一所大学的Ohta教授和Oikawa教授指示使用。数据标准化技术由Satou先生建立该协议被修改和附加参考原始，如"Integrated analysis of transcriptome and metabolome of Arabidopsis albino or pale green mutants with disrupted nuclear-encoded chloroplast proteins"（Satou等人，2014）。

参考文献

Oikawa，A.，Nakamura，Y.，Ogura，T.，Kimura，A.，Suzuki，H.，Sakurai，N.，Shinbo，Y.，Shibata，D.，Kanaya，S.and Ohta， 2006）。通过傅里叶变换离子回旋共振/基于质谱法的代谢表型研究来澄清途径特异性抑制。 Plant Physiol 142（2）：398-413。

Satou，M.，Enoki，H.，Oikawa，A.，Ohta，D.，Saito，K.，Hachiya，T.，Sakakibara，H.，Kusano，M.，Fukushima，A.，Saito， Kobayashi，M.，Nagata，N.，Myouga，F.，Shinozaki，K.and Motohashi，R。（2014）。拟南芥白色或转绿色突变体的转录组和代谢组的综合分析被破坏的核编码叶绿体蛋白。 Plant Mol Biol 85（4-5）：411-428。

Shinbo，Y.，Nakamura，Y.，Altaf-Ul-Amin，M.，Asahi，H.，Kurokawa，K.，Arita，M.，Saito，K.，Ohta，D.，Shibata，D.and Kanaya ，S.（2006）。 KNApSAcK：一个全面的物种 - 代谢物关系数据库。 Biotech Agric Forest 57：165-181。