材料和试剂

两到三周龄的小麦幼苗
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：746398）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：746436）
CaCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
KIX +液体离子交换剂（Sigma-Aldrich，目录号：60031）
三丁基氯硅烷（Sigma-Aldrich，目录号：282707）
ddH sub 2 O
95％乙醇（VWR International，目录号CHESEA042-20L-P）
商业漂白剂（含42g/L NaClO）
琼脂（Oxoid，目录号：LP0011）
parafilm
碱性盐介质（BSM）溶液（mM）（参见配方）
用于K ⁺离子选择性微电极的回填溶液（参见配方）
参比电极的填充溶液（参见配方）
K ⁺校准溶液（μM）（参见配方）
盆栽混合（见配方）

设备

MIFE（微电极离子流量估计）系统（由塔斯马尼亚大学设计，制造和分发）
（ http://www.phys.utas.edu。 au/physics/biophys/mifecom/MIFEHome/Home.html ）
温室
垂直电极拉出器（Narishige，型号：PP-830）
电极加油站（包含三维显微操作器和显微镜）
实验室通风橱（型号：1800）
倒置组织培养显微镜（Radical Instruments，型号：RTC-6）
显微镜（尼康，型号：100100）用于电极填充站
在电极填充站
中使用的微型操作器（Narishige，型号：MMT-5）
烤箱（Euromiad compact compacter，型号：MC 110T）
Distiller（Labglass，型号：03DD）
pH计（Thermo Fisher Scientific，型号：Orion 420A +）
燃烧器
磁力搅拌器（ISG 热板和磁力搅拌器，型号：153-005）和搅拌棒
硼硅酸盐玻璃毛细管（GC 150-10）（1.5 O.D.x 0.86 I.D.x100Lmm）（Harvard Apparatus，目录号：30-0053）
硼硅酸盐玻璃毛细管（GC 100-10）（1.0 O.D.×0.56I.D.×100Lmm）（Harvard Apparatus，目录号：30-0016）
培养皿（直径85mm和35mm）
用于固定叶子样品的有机玻璃支架
用于电极硅烷化的金属电极架
用于存储硅烷化电极坯料的塑料电极夹
标准手术刀（Kiato不锈钢，型号：BS 2982：1992，ISO 7740）
注射器（Terumo，目录号：SS-10L）
塑料针（20μl）（Eppendorf，目录号：5424956.003）
塑料涂层重量
银线（A-M Systems，目录号：787000）
4.5 L PVC（聚氯乙烯）锅

程序

植物材料准备
1. 使用标准品在4.5L PVC罐（具有碟）中播种12至14粒种子灌封混合并在玻璃温室条件下生长（白天/黑夜温度23/18℃; 〜11至13小时光周期）
2. 幼苗出苗后，细植物每盆留下八个均匀的植株。
3. 种植小麦植株，直到它们15到20天（图1）
  
  图1.在温室中生长的两周龄小麦幼苗
离子选择性微电极的制备
1. 电极空白预处理
  1. 插入非丝状硼硅酸盐玻璃毛细管（GC 150-10; 1.5 O.D.x 0.86 I.D.×100L mm）垂直电极拉出器
  2. 通过将中间部分加热成两个外部尖端直径约3-4μm的毛坯来拉出玻璃毛细管
  3. 将拉出的空白电极存放在不锈钢架中（图 2）处于垂直位置，其中尖端向上定位。
  4. 将带有空白电极的钢架放入位于通风橱柜中的烤箱中，并在225℃下加热过夜。
  5. 加热8-10小时后，用圆形钢盖盖住钢架，再加热15分钟。
  6. 在盖子下注入几滴三丁基氯硅烷（70μl 对于包含36个空白电极的钢架，图2）和热量a 进一步打开盖子10分钟。根据空白的数量电极在钢架上，注入的体积三丁基氯硅烷应调整
    
    图2.存放在金属电极架中的拉出的空白电极
  7. 从钢架上取下盖子，继续在烤箱中加热空白电极30分钟。
  8. 关闭烤箱，让电极坯料在烤箱内冷却。
  9. 将硅烷化的空白电极转移到电极夹（图3）并用盖子盖住。可以存储制备的电极坯料最多一个月。
    
    图3.有机玻璃制电极夹
2. 填充电极
  1. 通过浸渍拉制的硼硅酸盐制备含K LIX的管玻璃毛细管（GC 100-10; 1.0OD×0.56I.D.×100Lmm），其中a 破碎的尖端（〜50μm直径）装入含有K on + LIX的瓶中。
  2. 将硅烷化的电极坯料固定在微电极填充物中站和打破电极头对平面玻璃表面下显微镜（步骤1在图B4a中显示）以实现电极尖端直径为2-3μm。
  3. 水平制备K ⁺ LIX管在填充站中对准制备的微电极坯体（步骤2 如图4a所示。微电极的尖端和 LIX的显微镜下（图4b）
    
    图4.空白电极和含有K ⁺ LIX的玻璃毛细管在加注站对齐
  4. 用K ⁺回填溶液回填微电极，使用a 注射器用塑料针。确保没有任何气泡粘附在电极头中的玻璃毛细管上。添加更多回如果后者发生，则填充溶液
  5. 正面填充电极通过短暂地使电极头与开口尖端接触该含LIX的管实现约100-150μm的柱长度
  6. 将准备的微电极储存在含有碱性盐介质（BSM）溶液中（图5）
    
    图5.存储在BSM解决方案中的电极
参考电极的制备
1. 将拉断的具有破碎尖端（约50μm尖端直径）的空白微电极放入宽颈玻璃容器尖端。
2. 准备约50 ml 2％（w/v）琼脂的1M KCl溶液，并在水浴中融化。
3. 将熔化的琼脂溶液倒在制备的电极坯料上将它们完全浸没在琼脂溶液中。确保内部零件的玻璃毛细管用琼脂溶液填充。
4. 一旦冷却后，将玻璃容器的顶部密封，存放在冰箱中备用
5. 对于参考电极制备，切割〜5厘米的银线
6. 通过将银线浸入装有瓶子的氯化银线商业漂白剂〜1-2分钟，留下线的一端（〜5mm）暴露于空气。确保电线的浸入部分变黑。
7. 将氯化银线插入准备的参考电极空白（填充有1M KCl琼脂溶液的玻璃毛细管）。将银线的未氯化部分（5 mm）留在玻璃外毛细管
8. 用带条将玻璃毛细管中的银线固定的封口膜。确保导线的未氯化部分停留裸露。将制备的参比电极浸入容器中 BSM并将其存储在冰箱中，直到使用。
微电极校准
使用具有覆盖测量溶液中的预期K on +浓度的浓度的三种校准溶液来校准K sup +微电极。例如，对于含有500μMKCl的BSM，所用的KCl校准溶液为（μM）：250,500和1,000。
1. 在MIFE电极夹中准备K ⁺微电极，并确保所使用的通道连接到放大器。插入电极在BSM
2. 将参考电极连接到为参考电极指定的通道，并将其插入同一BSM中
3. 从相应的目录运行MIFE软件CHART（请参阅 http： //www.phys.utas.edu.au/physics/biophys/mifecom/MIFEHome/Home.html 了解详情）。
4. 按"Alt + S"即可创建校准文件。
5. 按F7以指定用于K ⁺微电极的通道。按"Enter"。
6. 将K ⁺微电极插入第一个K ⁺校准溶液 μM）。按F7指定使用的K ⁺浓度。记录校准输出20-30秒。一旦录制的线路是海峡，按F7到接受。如果线路不可接受，请在F7菜单中按"否" 重复校准。
7. 将K ⁺微电极插入其他校准溶液（500μM和1000μM，一次一个），并重复步骤D6。
8. 按"Alt + H"结束数据采集。然后按"Y"表示< Y>以确认您的选择
9. 在完成K ⁺微电极校准后，必须检查其质量。按"Alt + E"进入< E>测量仪菜单，然后选择"A"到< A>平均数据，然后按"C"进行< C& 平均。平均校准文件< .AVC>将由创建 CHART软件自动，以及有关一组的信息将在屏幕中显示K ⁺微电极的参数，例如斜率，截距和相关系数。
10. 检查显示的参数：只有K ⁺微电极，斜率大于50 mV 每十年并且接受大于0.999的相关系数可用于进一步的实验。如果校准结果不是满足要求，新电极必须做好准备校准过程重复。

准备标本

通过MIFE技术测量NaCl诱导的K ⁺从叶肉叶的流出量
1. 通过按"Alt + E"进入< E>测量仪菜单，然后为 < A>平均选项选择"A"，为< ; M>动物循环平均值。将打开一个"实验参数值"框。按 < Z> 和根的类型半径（以μm为单位）; 按< U> 和类型之间的距离根部和微电极（通常为40μm），然后按&OK; 屏幕中将出现一个新的框，其中显示有效时间。按< Enter>接受全部。 < .AVM> 文件将被创建。
2. 按"Alt + Q"退出CHART程序

流量计算
1. 通过在MIFE目录中键入"mflux"运行MIFEFLUX软件[有关详细信息，请参阅Shabala 等（2012）]。
2. 键入记录的AVC文件的名称（校准电极）。按照提示，然后键入AVM文件的名称需要进行通量计算。
3. 选择< C> 对于圆柱形扩散几何（Newman，2001; Shabala等人，2006），并按下< Enter>。具有扩展< .flx>的通量文件将生成。一样校准文件可用于计算更多通量文件。
4. 将流量文件复制到工作目录，并使用Excel进行数据分析。

助焊剂数据分析

打开Excel并找到感兴趣的通量文件，打开它。
绘制K ⁺通量值与时间并评估通量变化。负通量的值与K ⁺流量相关，值越大通过质膜的较高的K + sup/+流出。较低的是值，K ⁺保留能力（以及因此的耐盐性）越好
特别注意下面的峰值和稳态值不同条件下（在存在和不存在NaCl的情况下） BSM）。

笔记

需要温控室（〜23°C）。
K ⁺微电极必须每天更换。
具有K ⁺ LIX的毛细管必须每周更换一次
在硅烷化之后，微电极的平坦侧必须燃烧以避免刮擦氯化银线。
一般来说，参考电极必须每周更换一次。一旦更改参考电极，必须重新校准电极，生成的AVC文件用于使用相同参考电极生成的AVM文件的通量计算。
由于三丁基氯硅烷有毒，电极盐化应在通风橱中进行
在我们以前发表的论文中可以获得整个测量设置的概述图像（Wu等人，2014; Wu等人，2015）。

食谱

碱性盐介质（BSM）溶液（pH〜5.7）
0.1mM CaCl 2/v/v 0.5mM KCl
K ⁺离子选择性微电极的回填溶液
200 mM KCl
参比电极的填充溶液
1 M KCl
2％琼脂
K ⁺校准溶液（μM）
250，500和1000μMKCl
灌封混合料
80％堆肥松树皮
10％砂和10％椰皮，加上完全N：P：K（8：4：10），1kg/m 3 / 白云石，8kg/m 3
石膏，1kg/m 3
硫酸铁，1kg/m 3
异丁烯二脲，1kg/m 3 微量元素混合物，0.75kg/m 3 润湿剂，0.75Kg/m 3
沸石，0.75Kg/m 3 pH 6.0

致谢

该方案改编自我们以前的出版物（Wu等人，2014; Wu等人，2015;和Shabala等人）。 2012）。这项工作得到粮食研究和发展公司给予SS和MZ以及澳大利亚研究委员会发现赠款给SS的支持。

参考文献

Newman，I.A。（2001）。根系中的离子迁移：使用离子选择性微电极测量转运蛋白功能的特征。 > Plant Cell Environ 24（1）：1-14

Shabala，S.，Cuin，T.A.，Shabala，L。和Newman，I。（2012）。通过测量MIFE技术的非侵入性微电极对来自植物组织的净离子通量的动力学进行量化。 Methods Mol Biol 913：119-134
Shabala，S.，Demidchik，V.，Shabala，L.，Cuin，T.A.，Smith，S.J.，Miller，A.J.，Davies，J.M.and Newman，I.A。（2006）。细胞外Ca 2+ 2可以改善NaCl诱导的K ^{+ <通过控制质膜K ⁺ - 可渗透通道，从拟南芥根和叶细胞中丧失）：1653-1665。}
Shabala，S。和Newman，I.I。（1999）。氢，钙，钾和氯离子通量的光诱导变化和来自叶肉的浓度和豆叶的表皮组织。理解光致生物电生成的离子基础。植物生理学119（3）：1115-1124。
Wu，H.，Shabala，L.，Barry，K.，Zhou，M.and Shabala，S。（2013）。叶肉叶保留钾的能力与小麦和大麦的耐盐性有关。 em> Physiol Plant 149：515-527。
Wu，H.，Shabala，L.，Zhou，M。和Shabala，S。（2014）。硬粒小麦和面包小麦在叶片叶肉中保留钾的能力不同：对盐分胁迫耐受性的影响。植物细胞生理学 55（10）：1749-1762
Wu，H.，Zhu，M.，Shabala，L.，Zhou，M.and Shabala，S。（2015）。 K ⁺保留叶肉叶，这是一种被忽视的盐分耐受机制：大麦的案例研究。 57（2）：171-185。