材料和试剂

蓝藻培养（注1）
甲醇≥99.9％（GC）（Sigma-Aldrich）

设备

Eppendorf安全锁管（1.5 ml）
以15,000×g的相对离心力（RCF）和+4℃的冷却选择（Sigma-Aldrich，型号：1-16K）离心，
移液器100μl-1,000μl+移液器吸头（RAININ，Mettler-Toledo）
冰箱（+4°C）
具有狭缝宽度1nm（Shimadzu，型号：UV-2600）的分光光度计
分光光度法塑料或玻璃VIS/UV-VIS半微量0.75-1.5毫升比色皿
混合装置（Silamat S6，Ivoclar Vivadent）或涡流（IKA MS3 digital，IKA ）
铝箔
Eppendorf管支架

程序

在适度的辐照度下[高达5μmol（光子）m -1 s -1的白光或10μmol（光子）m <-2d/sup] >绿色光的^-1]，以防止所提取的颜料的降解。
收获1ml蓝藻培养悬浮液（注2）。
在实验室温度下将细胞以15,000×g离心7分钟，并彻底丢弃上清液。如果必要，重复离心（注3）
加入1ml甲醇，预冷至+ 4℃
通过混合（Silamat S6，2秒），涡旋（2,000rpm，4秒）或通过上下轻轻吹吸使样品均质化。
用铝箔覆盖样品。在+ 4°C孵育20分钟，以从细胞中提取颜料（注4）
在15,000×g/min，+ 4℃下离心7分钟，目视检查沉淀;它应该在蓝绿色和紫色之间（图1），没有绿色。如果颗粒是绿色的，重复步骤5-6

图1.在添加甲醇（A）之前和在叶绿素a和类胡萝卜素萃取（B）之后蓝细菌颗粒的颜色。甲醇萃取后的颗粒的颜色将是从蓝藻（ Synechocystis sp。PCC 6803）到紫色（ Lyngbya sp。IPPAS B-1204），取决于藻胆蛋白的特定组合。
使用甲醇作为空白校准分光光度计
通过分光光度计，狭缝宽度1 nm测量颜料浓度。
1. 在470nm，665nm和720nm测量样品和空白的吸光度（注5）
2. 根据方程计算叶绿素浓度 a ：
  （Ritchie，2006）。
  [μg/ml] = 12.9447（A sub 665-A 720） Chl _a [μM] = 14.4892（A _{665 720}）; 对于Chl a摩尔质量= 893.4890g/mol 类胡萝卜素[μg/ml] = [1,000（A 470 -A 720）-2.86（Chl a [μg/ml] 221（Wellburn，1994）。

根据每个颜料评估的平均值和标准偏差的计算，至少进行三次重复分析

代表数据

图2.在蓝细菌集胞藻属的细胞培养物中叶绿素a和类胡萝卜素浓度的代表性测量。 PCC 6803。将浓密蓝细菌培养物（叶绿素：22μg/ml，类胡萝卜素：7μg/ml）逐渐稀释一半直到颜料浓度为0.1μg/ml。每次测量一式三份;误差棒表示标准偏差。

笔记

作者不知道对于仅含有叶绿素a的蓝藻菌株，该方案用法的任何限制。该协议已成功应用于Cyanothece sp。 ATCC 51142，细长聚球藻（Synechococcus elongatus） PCC 7942，Cyanobacterium IPPAS B-1200， Synechocystis PCC 6803，慢性节旋藻 IPPAS B-256，Anabaena sphaerica IPPAS B-404，Chroococcus IPPAS B-1203， Lyngbya IPPAS B-1204， aphanocapsa IPPAS B-1205， IPPAS B-1206。
分析所需的细胞悬浮液的量可随培养物密度而变化。对于非常稀释的培养物，建议收获更大的培养体积;对于具有大约10ng（Ch1）ml培养物〜sup-1或更低，甚至高达5ml的叶绿素密度的培养物。相反，对于非常密集的培养物，推荐更低的样品体积 - 具有高细胞密度，一些颜料可以在提取后留在细胞中。
如果在第一次离心之后一些上清液留在管中，则提取不会在纯甲醇中进行，并且不能适当地测量颜料浓度。
颜料萃取时间可以延长至2小时，没有明显的颜料降解。
每个波长的最终吸光度应在线性吸光度范围内。对于分光光度计UV-2600（Shimadzu），该线性吸光度范围为0.01-2.5。如果需要，用甲醇稀释样品以适应分光光度计线性吸光度范围
在使用不同体积的蓝细菌样品和/或甲醇的情况下，1ml以上，最终的颜料浓度应按下式计算：

致谢

该方案采用自出版物"On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp。 ATCC 51142"（Sinetova等人，2012）。 T.Z.和J.C.由MEYS CR在CzechGlobe Center，reg。没有。 CZ.1.05/1.1.00/02.0073 484，国家可持续计划I（NPU I），授权号LO1415和EC OP项目，没有。 CZ.1.07/2.3.00/20.0256。 S. M. A.得到俄罗斯科学基金会资助。 14-24-00020）。

参考文献

Balizs，G.，Benesch-Girke，L.，Borner，S.and Hewitt，S.A。（1994）。使用液相色谱与猪肌肉组织中四种磺胺类药物及其N4-乙酰基代谢物的测定比较紫外和质谱检测。 66 Chromatogr B Biomed Appl 661（1）：75-84。

Ritchie，R.J。（2006）。一致的丙酮，甲醇和乙醇溶剂的分光光度法叶绿素方程组。 Photosynth Res 89（1）：27-41。

Sinetova，M.A.，Červený，J.，Zavřel，T。和Nedbal，L。（2012）。关于蓝细菌Cyanothece sp的分批培养生长的动力学和约束。 ATCC 51142. J Biotechnol 162（1）：148-155

Wellburn，A.R。（1994）。使用各种溶剂，使用不同分辨率的分光光度计，对叶绿素a和b以及总类胡萝卜素进行光谱测定。 J Plant Physiol 144：307-313。