材料和试剂

野生型水稻种子（<北>水稻 ssp。japonica cv。Kitaake）
含有pTA7002 :: Myc :: Xa21（P ，2012）的转基因水稻种子
含有Ubi :: Myc :: Xa21（2010）的转基因水稻种子</em>
Xanthomonas oryzae pv。（ Xoo ;菲律宾第六赛季，PXO99Az系列）
地塞米松（Sigma-Aldrich，目录号：D1756）
二甲基亚砜（DMSO）（Thermo Fisher Scientific，目录号：D128-1）
Tween-20（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-6531）
无菌H 2 O（Milli-Q）
TRIzol（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：15596-026）}
M-MLV逆转录酶（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：28025-013）}
SsoFastEvaGreenSupermix（Bio-Rad Laboratories，目录号：172-5203）
含有20μg/ml头孢氨苄（MP Biomedicals，目录号：02150585）的蛋白胨蔗糖琼脂（PSA）固体培养基（参见配方）
地塞米松（见配方）
温室水稻生长条件（见配方）
步入式生长室水稻生长条件（见配方）

设备

喷雾瓶（550 ml）（任何供应商）地塞米松叶面喷雾器
1.5 ml Eppendorf管（任何供应商）
外科剪刀（锋利/锋利，直，5½英寸或类似），用于 Xoo 剪裁接种
5½英寸方形一次性壶
Supertub（24英寸×36英寸×8英寸）（Mac Court Products，型号：ST3608或类似物）
适用于低至0.0001 g（任何制造商）的测量
适用于在600 nm（任何制造商）进行光密度测量的分光光度计
生长室（14小时光照和10小时黑暗光周期，28℃温度）（任何制造商）水稻种子发芽
用于Xoo 制备的孵育室（28℃）（任何制造商）
温室能够控制生长水稻的温度和湿度
用于Xoo 接种和地塞米松治疗的步入式生长室（环境或等同物）
qPCR机（Bio-Rad Laboratories，型号：CFX96实时PCR）

程序

水稻生长条件
1. 在培养皿（10cm直径）的滤纸上播种12-20个水稻种子，用10ml无菌水并将其置于孵育室中一周。
2. 将一周龄的幼苗移植到5 1/2英寸的盆中（每盆三棵幼苗），并在温室中种植大约再五个星期。对于灌溉，保持个别盆在充满受精水的supertubs，直到四个星期，然后继续用超滤水装满超级桶。
  注意：
  1. 水水平应保持在土壤表面附近，但不要高于防止绿藻覆盖盆中的土壤。
  2. 最大值每个supertub可以容纳24个罐，但是12个罐是最佳的这些实验允许盆之间的间距。
3. 当。。。的时候旗叶完全延伸，但在穗出现前（约发芽后6周）将植物转移到步入式生长室中用于 Xoo 接种和地塞米松治疗注意：
  1. 在接种之前允许植物至少三天使植物平衡到室条件。
  2. 根根经常生长在花盆底部。小心在将植物转移到步入式小室时最小化根损害
用 Xoo
接种水稻
1. 在将植物转移到步入式生长室前两天，将30μl的Xoo 从-80℃转移到含有PSA的固体培养基中头孢氨苄，并在28℃孵育三天，直到生物膜形成。
  注意：如果需要，生物膜形成后可以储存Xoo 在4°C直至准备好进行，但不应储存超过两个星期。
2. 在接种水稻前两天，传代培养距离原始PSA固体介质约1cm直径的Xoo 含有头孢氨苄的新型PSA固体培养基在28℃下孵育另外两天直到生物膜形成。
3. 在接种当天，从最新的PSA中暂停 Xoo 含有头孢氨苄的固体培养基在无菌H 2 O至OD 600 = 0.5中。
4. 通过将剪刀尖浸入Xoo悬浮液中接种稻叶并切割叶片大约2-3厘米远离叶尖 1 ^st和2 ^nd个叶子，或只是2个^nd叶子。预期细菌负荷接种后立即为约1×10 5 cfu/ml（Song et al al。，1995）。
  注意：对于未接种的对照，应该用剪刀将水稻叶片浸入水中。
5. 允许接种后五至七天，以便从中扩展 Xoo 接种的区域并且在稻上形成更均匀的分布叶。
  注：选择接种后5至7天因为基于以前的实验（Song等人，1995），显示了Xoo 在这段时间内完成对数增长阶段。后七天，疾病症状开始更明显。
地塞米松叶面喷雾
1. 在叶面施用当天，在550ml喷雾瓶中制备30μM地塞米松+ 0.01％吐温-20（400ml）。
2. 从12-24的距离每个supertub喷射200毫升地塞米松英寸远离植物，走在浴缸，当你喷雾和移动上下运动，确保喷雾均匀地施加到所有植物的部分。
  注意：
  1. 避免碰撞或干扰植物在这一步或地塞米松溶液将滑落叶子。
  2. 如果步入式生长室有一个强大的循环风扇，植物应放置在生长室内较不风的区域地塞米松应用作为球迷将引起地塞米松蒸发太快，地塞米松吸收可能不一样均匀。植物可以在地塞米松溶液不再可见后返回在叶子表面（1到2小时后）。
3. 收获组织地塞米松治疗后所需的时间点。收获组织，在接种的叶尖处3至5cm用灭菌切割剪刀并立即在液氮中冷冻。

代表数据

图1.使用地塞米松诱导系统的实验设计。用Xoo 接种六周大的稻植物。在地塞米松处理之前，pTA7002 :: Myc :: XA21植物（A）不表达XA21并对易感的Kitaake植物（B）进行phenocopy。接种后6天，将地塞米松应用于水稻植物，并且XA21开始表达，诱导强烈的免疫应答。在施用地塞米松后0小时，12小时和24小时收获叶组织，并在液氮中冷冻用于下游应用。在玉米泛素启动子控制下过表达的Ubi :: Myc :: XA21植物（C）（Park等人， 2010）抗 Xoo 并用作阳性对照。

图2.在地塞米松应用后 Xa21 的表达。在施用后在指定的时间点收获pTA7002 :: Myc :: XA21 <地塞米松。使用TRIzol使用标准方案提取RNA;用于定量PCR的cDNA用M-MLV逆转录酶转录;并在PCR仪上用SsoFastEvaGreenSupermix进行定量PCR。使用水稻泛素基因（LOC_Os06g46770）作为内部对照来标准化Xa21的基因表达，并且在Ubi :: Myc :: XA21 植物中表达水平作为 XA21 ）设置为1.0

图3.地塞米松处理抑制pTA7002 :: Myc :: XA21植物中损伤长度的延长。六周大的水稻植株用Xoo >。在接种后6天（6DAI），在将地塞米松（DEX）施用于植物之前测量疾病进展（红线）。直到6个DAI，pTA7002 :: Myc :: XA21 植物不表达Xa21，并且观察到的DEX和没有DEX处理的植物之间的疾病发展变化不具有统计学显着性。使疾病进展持续到接种后12天（12DAI，DEX处理后6天），并如所示测量病变长度（蓝线）。与非地塞米松处理的植物相比，用地塞米松处理的pTA7002 :: Myc :: XA21 植物显示出显着更少的疾病进展，表明DEX处理成功诱导Xa21的表达， XA21 - 介导的免疫被触发。

笔记

在没有激素的情况下的"泄漏"表达先前已经在化学诱导系统中报道（Padidam，2003; Zuo和Chua，2000）。在我们的系统中，约一半的独立转化的水稻品系表现出弱或中度渗漏表达（Park等人，2012）。因此，确定显示最低泄漏表达同时保持高度诱导表达的转基因株系是至关重要的。为了确认 Xa21 的非渗漏表达，在没有DEX的情况下，所选择的行应该完全易受 Xoo 的影响，并且在DEX之后对 Xoo 应用。另外，在DEX处理之前，通过定量RT-PCR和western印迹分析，Xa21基因表达和蛋白质丰度应当低或不可检测，并且应该通过DEX应用诱导（Park等人， em>，2012）。
为了确保地塞米松治疗成功，接种另外的植物并保持而不收获叶子以在接种后12至14天测量损伤。
在我们的经验中，当我们使用分开的步入式生长室用于地塞米松和非地塞米松处理时，我们观察到Kitaake（地塞米松处理的）和地塞米松诱导的XA21细胞之间的 Xoo 即使当相同的设置应用于两个步入式生长室（数据未显示）时，植物（非地塞米松诱导的）因此，我们建议将实验限制于单一生长室，其中地塞米松应用于所有植物，并且Kitaake野生型稻用作对照。
根据大学生物安全协议，将植物转移到步入式生长室中以接种Xoo。作者怀疑，接种和地塞米松的应用在温室中也应该是成功的，尽管这些条件没有被测试。
在我们的预实验中，我们将30μM地塞米松叶面施用与10μM地塞米松灌溉组合。但是，与单独的叶面应用相比，我们没有看到更多的 Xa21 表达式（数据不是显示）。

食谱

含有头孢氨苄（1L）的蛋白胨蔗糖琼脂（PSA）固体培养基头孢氨苄储备液的制备：将头孢氨苄水合物溶解在50％乙醇中的10mg/ml，并将2ml等分试样储存在-20℃，直到准备好准备培养基。
将10克蛋白胨，10克蔗糖和1克L-谷氨酸溶于900毫升无菌H 2 O中。
使用1N NaOH将培养基的pH调节至7.0，并使体积达到1L
加入16g琼脂和高压灭菌器灭菌
使溶液冷却至55℃，并加入2ml原料头孢氨苄至终浓度为20μg/ml。
地塞米松，含有0.01％（w/v）Tween-20（400ml）的30μM溶液
对于两个supertubs，将0.0048g地塞米松溶解在400ml DMSO中的1.5ml eppendorf管中
溶解后，将其加入到含有40μltween-20的400ml无菌H 2 O中。
温室水稻生长条件
温室（26-28℃光，18-20℃黑暗，40-60％湿度）从4月到9月，自然光线
从10月到3月，从上午6点到晚上10点（14小时光照和10小时黑暗光周期），补充了1000W金属卤化物灯泡的光
步入式生长室水稻生长条件
步入式生长室（14小时光照，28℃，80％湿度; 10小时黑暗，24℃，85％湿度）
受精水成分
受精水保持在EC：0.8-1
当以1:200：
注射时PPM的理论分解

N
173.58

P
45.39

K
165.64

Ca
60.05

Mg
38.88

S
146.42

Fe
5.23

Cu
0.18

B
0.4

Mn
1.20

Mo
0.05

Zn
0.37

致谢

该协议由Park等人修改（（2012）。
这项研究由国家卫生研究所（NIH，GM55962），国家科学基金会（NSF，IOS-0817738）和孟山都的Beachell-Borlaug国际学者计划支持。

参考文献

Aoyama，T。和Chua，N.H。（1997）。转基因植物中糖皮质激素介导的转录诱导系统。植物J/em> 11（3）：605-612。
Padidam，M。（2003）。植物中的化学调节基因表达。Curr Opin Plant Biol 6（2）：169-177。
Park，C.J.，Canlas，P.E.and Ronald，P.C。（2012）。建立糖皮质激素介导的水稻转录诱导XA21 模式识别受体。 55（1）：43-49
Park，C.J.，Lee，S.W.，Chern，M.，Sharma，R.，Canlas，P.E.，Song，M.Y.，Jeon，J.S.and Ronald，稻的异位表达 Xa21 克服了发育上受控的对黄单胞菌的抗性米曲霉oryzae 。 Plant Sci 179（5）：466-471。
Song，WY，Wang，GL，Chen，LL，Kim，HS，Pi，LY，Holsten，T.，Gardner，J.，Wang，B.，Zhai，WX，Zhu，LH，Fauquet， P.（1995）。由水稻抗病基因编码的受体激酶样蛋白， Xa21 。 Science 270（5243）：1804-1806。
Zuo，J。和Chua，N.H。（2000）。化学诱导系统，用于调控植物基因的表达。 Curr Opin Biotechnol 11（2）：146-151。

附录

Myc :: Xa21 的核苷酸序列。下划线区域定义N末端Myc标签。如先前所述，将Myc标签插入推定的信号肽（结构域A）之后的Xa21基因的结构域B中（Park等，，2010）。
atgatatcactcccattattgctcttcgtcctgttgttctctgcgctgctgctctgcccttcaagcagtgacgacgatggtgatgctgccggcgacgaactcgcgctgctctctttcaagtcatccctgctataccaggggggccagtcgctggcatcttggaacacgtccggccacggccagcactgcacatgggtgggtgttgtgtgcggccgccgccgccgccggcacccacacagggtg GAGCAAAAGCTGAACCCACAACACACGCCGGCGGCGGCGGCGGCCGTGGGTGTGTCCCACCTCGTTTTCGACTTTTCTGAGGAGGATCTGCTGGAGAAGCACAGGCTG gtgaagctgctgctgcgctcctccaacctgtccgggatcatctcgccgtcgctcggcaacctgtccttcctcagggagctggacctcggcgacaactacctctccggcgagataccaccggagctcagccgtctcagcaggcttcagctgctggagctgagcgataactccatccaagggagcatccccgcggccattggagcatgcaccaagttgacatcgctagacctcagccacaaccaactgcgaggtatgatcccacgtgagattggtgccagcttgaaacatctctcgaatttgtacctttacaaaaatggtttgtcaggagagattccatccgctttgggcaatctcactagcctccaggagtttgatttgagcttcaacagattatcaggagctataccttcatcactggggcagctcagcagtctattgactatgaatttgggacagaacaatctaagtgggatgatccccaattctatctggaacctttcgtctctaagagcgtttagtgtcagagaaaacaagctaggtggtatgatccctacaaatgcattcaaaacccttcacctcctcgaggtgatagatatgggcactaaccgtttccatggcaaaatccctgcctcagttgctaatgcttctcatttgacagtgattcagatttatggcaacttgttcagtggaattatcacctcggggtttggaaggttaagaaatctcacagaactgtatctctggagaaatttgtttcaaactagagaacaagatgattgggggttcatttctgacctaacaaattgctccaaattacaaacattgaacttgggagaaaataacctggggggagttcttcctaattcgttttccaatctttccacttcgcttagttttcttgcacttgaattgaataagatcacaggaagcattccgaaggatattggcaatcttattggcttacaacatctctatctctgcaacaacaatttcagagggtctcttccatcatcgttgggcaggcttaaaaacttaggcattctactcgcctacgaaaacaacttgagcggttcgatcccgttggccataggaaatcttactgaacttaatatcttactgctcggcaccaacaaattcagtggttggataccatacacactctcaaacctcacaaacttgttgtcattaggcctttcaactaataaccttagtggtccaatacccagtgaattattcaatattcaaacactatcaataatgatcaatgtatcaaaaaataacttggagggatcaataccacaagaaatagggcatctcaaaaatctagtagaatttcatgcagaatcgaatagattatcaggtaaaatccctaacacgcttggtgattgccagctcttacggtatctttatctgcaaaataatttgttatctggtagcatcccatcagccttgggtcagctgaaaggtctcgaaactcttgatctctcaagcaacaatttgtcaggccagatacccacatccttagcagatattactatgcttcattccttgaacctttctttcaacagctttgtgggggaagtgccaaccattggtgctttcgcagctgcatccgggatctcaatccaaggcaatgccaaactctgtggtggaatacctgatctacatctgcctcgatgttgtccattactagagaacagaaaacatttcccagttctacctatttctgtttctctggccgcagcactggccatcctctcatcactctacttgcttataacctggcacaagagaactaaaaagggagccccttcaagaacttccatgaaaggccacccattggtctcttattcgcagttggtaaaagcaacagatggtttcgcgccgaccaatttgttgggttctggatcatttggctcagtatacaaaggaaagcttaatatccaagatcatgttgcagtgaaggtactaaagcttgaaaatcctaaggcgctcaagagtttcactgccgaatgtgaagcactacgaaatatgcgacatcgaaatcttgtcaagatagttacaatttgctcgagcattgataacagagggaacgatttcaaagcaattgtgtatgacttcatgcccaacggcagtctggaagattggatacaccctgaaacaaatgatcaagcagaccagaggcacttgaatctgcatcgaagagtgaccatactacttgatgttgcctgcgcactggactatcttcaccgccatggccctgaacctgttgtacactgtgatattaaatcaagcaatgtgctgttagattctgatatggtagcccatgttggagattttgggcttgcaagaatacttgttgatgggacctcattgatacaacagtcaacaagctcgatgggatttatagggacaattggctatgcagcaccagagtatggcgttgggctcattgcatcaacgcatggagatatttacagctatgg aattctagtgctggaaatagtaaccgggaagcggccaactgacagtacattcagacccgatttgggcctccgtcagtacgttgaactgggcctacatggcagagtgacggatgttgttgacacgaagctcattttggattctgagaactggctgaacagtacaaataattctccatgtagaagaatcactgaatgcattgtttggctgcttagacttgggttgtcttgctctcaggaattgccatcgagtagaacgccaaccggagatatcatcgacgaactgaatgccatcaaacagaatctctccggattgtttccagtgtgtgaaggtgggagccttgaattctga
pTA7002 :: Myc :: Xa21 构建地图。
SP信号肽，RB右边界，35花椰菜花叶病毒35S启动子，GVG GAL4结合结构域，VP16激活结构域 - 糖皮质激素受体融合物，E9聚（A）核糖核酸双磷酸羧化酶小亚基（rbcS-E9），NOS-P胭脂碱合酶启动子，NOS-T胭脂碱合酶终止子的加成序列; 6×UAS 6个拷贝的GAL4上游激活序列和³⁵ S启动子的-46至+1区，豌豆rbcS-3A，LB左边界的3A聚（A）添加序列。