材料和试剂

小鼠白蛋白ELISA定量集（Bethyl Laboratories，目录号：E90-134）
注意：此组包括用于包被的抗小鼠白蛋白山羊抗体，小鼠参考血清和HRP缀合的抗小鼠白蛋白山羊抗体。
小鼠血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A3139）
SureBlue TM TMB微孔过氧化物酶底物（Kirkegaard& Perry Laboratories，目录号：52-00-01）
用于TMB微孔底物（SurModics，目录号：LSTP-0100-01）的450nm BioFX？液体Nova-Stop溶液
BCA蛋白测定试剂A（Thermo Fisher Scientific，目录号：23221）
BCA蛋白测定试剂B（Thermo Fisher Scientific，目录号：23224）
牛血清白蛋白（BSA）组（Thermo Fisher Scientific，目录号：23208）
戊巴比妥钠盐（Nacalai Tesque，目录号：26427-14）
PBS（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-24946）
Triton X-100（Nacalai Tesque，目录号：35501-15）
三（羟甲基）氨基甲烷（Nacalai Tesque，目录号：35409-45）
HCl（Nacalai Tesque，目录号：18321-05）
NaCl（Nacalai Tesque，目录号：31320-05）
NP-40（Nacalai Tesque，目录号：23640-94）
脱氧胆酸（Wako Chemicals USA，目录号：044-18812）
SDS（Nacalai Tesque，目录号：31607-65）
EDTA（Nacalai Tesque，目录号：15114-15）
苯甲基磺酰氟（Enzo Life Science，目录号：ALX-270-184-G025）
抑酶肽（Sigma-Aldrich，目录号：A6103）
PBS（请参阅配方）
PBST（参见配方）
裂解缓冲液（见配方）

设备

剪刀（Fine Science Tools，目录号：14002-14）
镊子（Fine Science Tools，目录号：11271-30）
Hemostats（Fine Science Tools，目录号：13002-10）
翼针（Terumo，目录号：SV-27DL）
注射器（Terumo，目录号：SS-30ESZ）
Razor（FEATHER安全剃刀，目录号：FH-10）
丙烯酸脑切片机（Muromachi Kikai，目录号：MK-MC-01）
1.5ml取样管（Bio-Bik，目录号：RC-0170）
15ml锥形管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：REF352196）
96孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：167008）
移液管吸头（2至200μl）（Eppendorf，目录号：0030 073.800）
立体定位装置（Narishige，型号：SR-6N）
ELISA板组（Sumitomo Bakelite，目录号：BS-X7310）
注意：该套件包括ELISA板，板密封，抗体固定溶液和浸泡溶液。
微量移液管（2至20μl和20至200μl，Eppendorf）
酶标仪（Bio-Rad Laboratories，型号：680）
数字超声波^®（Branson，型号：250D）
离心机（Hitachi，型号：CF15RXII）
微孔板混合器（AS ONE Corporation，型号：NS-4P）

程序

通过大脑冷损伤破坏BBB [参见Michinaga等人的材料和方法（2014）]
在麻醉下将小鼠（5至6周龄的雄性ddY，SLC）置于立体定位装置（Narishige，型号：SR-6N）中。头皮在中线切开，头骨暴露。将铜棒（10cm长，4mm直径）保持在装有粉末干冰的50ml锥形管中。将冷却的棒设置在具有锥形管的显微操作器上。将冷却的棒的尖端应用于左半球的颅骨，在前囟后3mm和前囱侧面5mm的位置60秒。在这项研究中，损伤的小鼠回收72 h之前灌注

图1。大脑寒冷伤害的程序。左侧照片中显示了铜杆（10厘米长，4毫米直径）。将其置于50ml锥形管中并用干冰粉末冷却。在麻醉下将小鼠置于立体定位装置中后，将冷却的棒连接在左半球上的中间和右照片所示的颅骨上。
鼠标灌注
1. 进行实验操作，以重现大脑侮辱。中断的BBB和脑水肿将逐渐发展。
2. 通过戊巴比妥麻醉小鼠（50mg/kg，腹腔注射）
3. 执行剖腹术，直到心脏清晰可见。
4. 撕开肝脏流出循环血液。
5. 连接机翼针和注射器。
6. 将有翼的针刺入左心室，慢慢地流入50 ml PBS约20分钟，检查血液的流出肝。
来自小鼠大脑的蛋白质样品
1. 用剪刀灌注后摘除小鼠，用镊子剥离头骨。
2. 设置大脑在丙烯酸的大脑切片机和切大脑冠状脑切片（4mm厚，1〜5mm后）前囟石）（图2A-C）
3. 收集脑组织在含有200μl裂解缓冲液的取样管（图2D）。
4. 通过Digital Sonifier（20kHz，200W）（图2E-F）均质化脑组织。
5. 将裂解物在15,000×g离心10分钟，在4℃
6. 收集上清液在取样管（图2G）
  
  图2.使用PBS和灌注的大脑的集合的小鼠灌注的程序。 A。分离灌注的小鼠大脑并置于丙烯酸脑切片机中。 B.切割冠状脑切片中的大脑。 C.从冠状脑切片分离损伤的皮质。 D.损伤的小鼠皮质的收集。将损伤的皮质收集在含有200μl裂解缓冲液的取样管中。 E.显示了用于均质化的数字超声波仪^®。 F.将收集的半球通过Digital Sonifier匀浆。将匀浆的样品离心后，将上清液收集在取样管中。
蛋白质测量
1. 通过裂解缓冲液稀释样品10倍
2. 向96孔板的每个孔中加入20μlBSA标准品（0，125，250，500和750μg/ml）或20μl样品。
3. 在15ml锥形管中混合BCA蛋白测定试剂A和BCA蛋白测定试剂B（比率为50:1）。
4. 向96孔板的每个孔中加入150μlBCA蛋白测定试剂A和BCA蛋白测定试剂B的混合物。
5. 在室温（RT）下孵育30分钟
6. 通过酶标仪测量OD 570nm处的吸光度。在ELISA之前将蛋白质样品稀释为0.2mg/ml。
ELISA板的制备
1. 用1/100稀释抗小鼠白蛋白山羊抗体与固定溶液
2. 向每个孔中加入100μl稀释的抗小鼠白蛋白。
3. 密封板，并在室温下孵育4小时
4. 用PBST冲洗板（每孔200μl）3次。
5. 向每个孔中加入200μl浸泡溶液。
6. 在室温下孵育5分钟。
7. 在RT下干燥板。
8. 包装平板并在4°C下储存过夜。如果您想在一天内完成ELISA，您可以跳过此步骤。
ELISA
1. 稀释每种浓度的小鼠血清白蛋白（0，6.25，12.5，50和 100ng/ml）。使用这些小鼠血清白蛋白溶液作为标准解决方案。
2. 在室温下孵育5分钟。
3. 在RT下干燥板。
4. 包装平板并在4°C下储存过夜。如果您想在一天内完成ELISA，您可以跳过此步骤。
ELISA
1. 稀释每种浓度的小鼠血清白蛋白（0，6.25，12.5，50和 100ng/ml）。使用这些小鼠血清白蛋白溶液作为标准解决方案。
  ...
2. Wash the plate with PBST (200 µl to each well) by using a microplate mixer at medium speed for 5 min 5 times.
3. Add 100 µl of SureBlue^TM TMB Microwell Peroxidase Substrate to each well.
4. Incubate at RT for 5 min.
5. Add 100 µl of 450 nm BioFX^® Liquid Nova-Stop Solution for TMB Microwell Substrates to each well.
6. Read the plate using a microplate reader at 450 nm.
7. Calculate the concentrations of albumin using the standard curve.

Representative data

Albumin contents in the mouse cerebrum after cold injury (with PBS perfusion).

Table 1. Concentrations of albumin standard solutions and their OD₄₅₀ values. Absorbance of albumin standard solutions was measured at 450 nm. The Albumin standards were duplicated and the averages of duplicated standards were shown.

Figure 3. Standard curve of albumin solutions. The standard curve was designed from the OD₄₅₀ values and the concentrations of albumin standard summarized in Table 1. The vertical axis shows the value of OD₄₅₀ and the horizontal axis shows albumin standard content.

Table 2. Albumin contents in the perfused mouse cerebrum after cold injury. After cold injury, mice were perfused with PBS. The albumin contents (ng/ml) in mice cerebrum were calculated by equation from the standard curve shown in Figure 3. Brain tissue extracts were diluted at 0.2 mg/ml. Albumin/brain tissue protein (ng/mg) were calculated by dividing albumin contents (ng/ml) by brain tissue protein contents (0.2 mg/ml).
冷损伤后的小鼠大脑中的白蛋白含量（不含PBS灌注）
表3.白蛋白标准溶液的浓度及其OD 450 值。与表1一样，在450nm测量标准溶液

图4.白蛋白溶液的标准曲线。标准曲线由表3中的数据设计。纵轴显示OD450值，横轴显示白蛋白标准含量。

表4.冷损伤（无PBS灌注）后灌注的小鼠大脑中的白蛋白含量。在冷损伤后，收集小鼠大脑。通过方程从图4所示的标准曲线计算小鼠大脑中的白蛋白含量（ng/ml）。将脑组织提取物以0.2mg/ml稀释。通过用白蛋白含量（ng/ml）除以脑组织蛋白质含量（0.2mg/ml）计算白蛋白/脑组织蛋白质（ng/mg）。

笔记

在非受伤脑中，很少观察到血清蛋白的外渗。如上所述，通过用PBS灌注，非损伤小鼠的脑白蛋白含量降低到非常低的水平。这表明成功洗出脑血管中的血液成分的重要性。

食谱

PBS
用蒸馏水稀释10x PBS
PBST
PBS
0.05％Triton X-100
裂解缓冲液
20mM Tris/HCl（pH7.4）将三（羟甲基）氨基甲烷溶解在蒸馏水中，用HCl调节pH值
150mM NaCl 1％（v/v）NP-40
0.5％（v/v）脱氧胆酸 0.1％（w/v）SDS
0.5％（w/v）EDTA
2mM苯甲基磺酰氟 10μg/ml抑肽酶

致谢

这项工作得到了来自JPSP（21590108）的科学研究助理（C）的支持。

参考文献

Michinaga，S.，Nagase，M.，Matsuyama，E.，Yamanaka，D.，Seno，N.，Fuka，M.，Yamamoto，Y.and Koyama，Y。通过选择性内皮素ET亚型改善冷损伤诱导的皮质脑水肿形成 > receptor antagonists in mice。 PLoS One 9（7）：e102009。