材料和试剂

7-8周龄雌性C57Black/6小鼠（Janvier Labs）
RPMI-1640培养基（RPMI）（Life Technologies，目录号：52400-041）
胶原酶III型（Worthington Biochemical，目录号：LS004180）
DNase I（Roche Diagnostics，目录号：04536282001）
肝素（来自猪肠粘膜的钠盐）（Sigma-Aldrich，目录号H3393-1MU）
没有钙或镁或酚红的Hank's缓冲盐溶液（HBSS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：14175-053）
NH 4 Cl（Merck KGaA，目录号：01145.0500）
KHCO 3（Merck KGaA，目录号：04854.0500）
EDTA（Duchefa Biochemie，目录号：E0511.1000）
HCl（37％储备溶液）（Merck KGaA，目录号：1.00317.1000）
胎牛血清（FBS）（Biowhittaker /Lonza，目录号：DE14-801F）
Lymphoprep ^TM（Axis-shield，目录号：1114547）
Percoll ^TM（GE Healthcare，目录号：17-0891-01）
纯化的CD16/CD32（Fc区段）（克隆2.4G2）（BD Biosciences，目录号：553142）
PE-Cy7缀合的抗CD11b抗体（克隆M1/70）（BD Biosciences，目录号：552850）
AF647缀合的抗Ly6C抗体（克隆ER-MP20）（Serotec，目录号：MCA2389A647）
PerCP-Cy5.5-结合的抗I-A/I-E（MHC-II）抗体（克隆M5/114.15.2）（Biolegend，目录号：107626）
FITC缀合的抗Ly6G抗体（克隆1A8）（BD Biosciences，目录号：551460）
APC-Cy7缀合的CD45抗体（克隆30-F11）（BD Biosciences，目录号：103116）
PE缀合的F4/80抗体（克隆C1：A3-1）（AbD Serotec，目录号：MCA497PET）
台盼蓝（BDH Chemicals，目录号：34078）
NaCl（Thermo Fisher Scientific，目录号：10428420）
（Merck KGaA，目录号：1.04873.1000）< />
（Merck KGaA，目录号：1.06580.1000）
的水溶液中，在室温下， >
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G8540-100G）
青霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
丙酮酸钠（Life Technologies，Gibco ，目录号：11360-039）
非必需氨基酸（Life Technologies，Gibco ，目录号：11140-035）
肝消化介质（见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
33％Percoll工作溶液（见配方）
红细胞裂解缓冲液（参见配方）
MACS缓冲区（参见配方）
细胞悬浮培养基（参见配方）
封锁介质（参见配方）
完整介质（见配方）
台盼蓝工作溶液（见配方）

设备

聚酯过滤器切割成10×10cm正方形，螺纹直径70μm（Spectrumlabs，目录号：146490）
10ml注射器（Omnifix，目录号：473203）
BD Falcon 50ml聚丙烯管（BD Biosciences，目录号：2070）
BD Falcon 15ml聚丙烯管（BD Biosciences，目录号：2096）
BD Falcon 5ml聚丙烯圆底管（BD Biosciences，目录号：352063）
针（Microlance 22G1,1/2,0.7×40mm）（BD Biosciences，ref：301000）
无菌培养罩
外科剪刀和镊子
37℃，5％CO 2细胞培养箱（Forma Scientific）
移液器
离心机（Eppendorf，型号：5810R和5417C）
轨道摇床（Belgolabo，型号：Julabo型SW-20C）以200rpm使用
光学显微镜（Olympus，型号：CK2）
多色流式细胞仪（BD Biosciences，FACSCanto ^TM）
GentleMACS TM解离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-093-235）
GentleMACS TM管（Miltenyi Biotec，目录号：130-093-237）

程序

肝单细胞悬液的制备
1. 牺牲鼠标使用CO 2并通过将其爪子固定到一个约束泡沫表面使用注射器针。值得注意的是，所有鼠类实验根据ECPVA指南（CETS n°123）进行批准VUB伦理委员会（许可证编号：08-220-8）。通过心脏穿刺（〜1ml）采集肝素化的血液以便防止在服用肝脏时太多的血液污染。或者，可以通过门静脉在体内灌注肝脏用10ml盐水。从尾部的基部做一个平行的切口到沿着鼠标的腹部和没有爪子的颈部穿刺腹膜。轻轻拉回皮肤，并将其固定到泡沫表面。随后，打开鼠标腹部，轻轻地移动肠道在侧面使用棉塞获得肝脏。
2. 轻轻地从身体取出肝脏，而不损坏它
3. 将收获的肝脏在冰上的50ml Falcon管中的5ml RPMI培养基中，直到消化过程
4. 将肝脏置于GentleMACS ^{TM C管中并加入5ml肝消化中。随后，使用切成小块（1-1.5mm）的肝脏（图1A/B）。}
5. 使用肝脏均质化使用2次程序mLiver_01_03进行GentleMACS TM离解（图1C）（16秒）。随后，在37℃孵育20-30 min，同时在水浴中摇动以允许组织消化
6. 在室温下使用GentleMACS TM离解剂程序mLiver_02_03（25秒）再次使肝脏悬浮液均质化（图 1D）。最后，加入5ml阻断介质以阻止肝消化。
7. 为了测量全肝中的细胞因子含量，收集 0.5ml溶液在1.5ml Eppendorf管中并在其离心 10,625×g/g，在室温下8分钟。随后，收集上清并储存于-20℃直至需要。
8. 过滤剩余肝脏悬浮液通过70-μm无菌尼龙纱布进入无菌50ml锥形管。洗涤GentleMACS ^TM C管额外的20ml阻断溶液，并再次冲洗过滤器有了这个。
9. 在4℃下以450xg离心50分钟8分钟，轻轻弃去上清液。
10. 通过在5中重悬细胞沉淀来消除红细胞 ml冰冷的红细胞裂解缓冲液，并在冰上放置2-3分钟。
11. 通过加入25ml细胞悬浮培养基中和裂解，和通过70-μm无菌将悬浮液转移到新的50ml管中尼龙纱布。
12. 在4℃下以450×g离心50分钟8分钟，轻轻弃去上清液。
13. 重悬细胞沉淀在5ml细胞悬浮培养基中，并使用台盼蓝计数活细胞。
  在这个阶段，悬浮液含有实质（肝细胞）和非实质（包括多形核细胞，单核细胞，巨噬细胞，DC，NK和NKT细胞）肝细胞。虽然这样悬浮液可以通过流式细胞术进行分析，建议进行额外的分级步骤以允许细胞培养和/或 FACS分选。
使用Lymphoprep梯度分离分离肝细胞
1. 缓慢加入10 ml Lymphoprep？sup？（Lucron Bioproducts）使用具有长针的10ml注射器重悬浮肝细胞溶液。以800×g离心25分钟，在20℃，没有加速或制动（图1E）。
2. 小心收集低密度细胞层包含非实质肝细胞（富含单核骨髓细胞以及T，B和NK/NKT细胞）。如果间期不清晰可见（细胞数量少）你也可以收集上层相（含RPMI培养基）。采取少于可能的下层包含Lymphoprep（图1E）。
3. 转移中间相到一个新的无菌15毫升管和填充到顶部与MACS缓冲区。在20℃下以800×g离心7分钟并弃去上清液。重悬细胞沉淀在1-2毫升细胞悬浮液培养基中，并且在使用台盼蓝计数细胞后，浓度为10 7个细胞/ml
4. 去除Lymphoprep后，收集主要含有实质细胞的低级分（沉淀）（肝细胞）和多形核（PMN）细胞在非实质细胞部分中由于它们的高密度特征并将其转移至无菌的15ml Falcon管（图 1E）。将细胞重悬在最终体积为15ml的细胞悬浮液中并在20℃下以650×g离心8分钟
5. 随后，为了去除Lymphoprep溶液进行1-2 洗涤步骤为15ml细胞悬浮培养基。最后，重新悬挂在3ml细胞悬浮培养基中沉淀，并在计数细胞后使用台盼蓝，使浓度为10 7个细胞/ml。
  的间期（非实质细胞）部分现在可用于FACS 分析/分选以及细胞培养条件。底端含有肝细胞和剩余的非实质细胞（PMN 以及具有更高密度的巨噬细胞）也可以用于流式细胞术分析。后一部分可以进一步净化使用Percoll梯度以从肝中分离肝细胞剩余的非实质细胞。值得注意的是，如果不需要肝细胞 DNase 1可以添加到消化培养基中，导致更清洁样品
使用Percoll梯度分离分离肝细胞
1. 要从PMN和剩余的巨噬细胞分离肝细胞，混合1 vol。（〜5ml的10μL/ml工作溶液）的细胞悬浮液中 vol。的密度为1.07g/ml的等渗Percoll溶液（33％工作解）。在室温下以800×g离心30分钟（图 1F）。吸出肝细胞，形成宽带的密度 1.07-1.09g/ml，从梯度洗脱除去Percoll两次在800×g离心5分钟的另外的离心循环再悬浮于3ml细胞悬浮培养基中
2. 取出后 Percoll，收集主要含有PMN的下部细胞沉淀部分和未保留在非实质内的巨噬细胞由于它们的密度特性并将其转移到a 无菌15ml Falcon管
3. 随后，在650×g离心5分钟。在4℃下，将沉淀重悬于1ml细胞悬浮培养基中，使用台盼蓝计数细胞，并使它们的浓度 10 细胞/ml。
  在部分B和C中获得的不同级分可用于流式细胞术分析或当完全重悬时培养基用于体外细胞培养
  
  图1.肝单细胞制备 A.在5ml消化培养基中的GentleMACS TM管中的肝脏。 B.用剪刀切割后的GentleMACS ^TM C管中的肝脏。 C。解离器。 D.肝脏在GentleMACS ^TM C管中消化和使用GentleMACS TM离解器均质化。随后，过滤悬浮液并裂解RBC。 E.渐变之后离心，具有清晰可见的间期（非实质细胞，红色箭头）和沉淀（肝细胞和剩余的非实质细胞具有更高的密度）。 F.可选：Percoll梯度后用明显可见的上部分（肝细胞，蓝色）离心箭头）和颗粒（PMN和剩余的非实质细胞具有更高密度）。
流式细胞分析
1. 转移100μl的10 7个细胞/ml不同的储备溶液级分[（界面Lymphoprep（部分B），沉淀Percoll（部分 C）]加入到5ml聚丙烯圆底管中以防止粘连细胞。用1μg大鼠抗小鼠CD16/CD32孵育细胞悬浮液 FcR阻断抗体克隆（2.4G2，每10 6个细胞1μg）在冰水上 20分钟。
2. 随后，加入荧光标记的抗体（0.2μg/10 6个细胞）在冰水上再保温20分钟，保护暴露于光。使用的抗体是FITC缀合的Ly6G， PE缀合的F4/80，APC缀合的Ly6C，APC-Cy7缀合的CD45， PE-Cy7缀合的抗CD11b和PerCP-Cy5.5缀合的MHC-II
3. 通过加入2ml冰冷的MACS缓冲液洗涤，在450×g离心6小时 min，并弃去上清液。加入100-200μl细胞悬浮液培养基以保持细胞存活，将细胞转移到FACS管中，继续到FACSCanto ^TM。
4. 使用FlowJo分析FACS数据软件。简而言之，在选择生命门和单细胞（使用a FSC-A对比FSC-H谱）选择CD45中的CD45 ⁺细胞 FSC-A图（图2，上图和下图）。在CD45 ⁺细胞内，基于它们的CD11b ^pos Ly6G ^pos表达谱轮廓选出PMN，选择CD11b ^pos Ly6G ^neg表达细胞（图3A）。的 CD11b ^neg Ly6G ^neg群主要由T细胞，B细胞和 NK细胞。接下来，在Ly6C相对于MHC-II中绘制CD11b ^{pos Ly6G ^neg细胞并随后检查F4/80表达。因此，单核细胞 Ly6C高/低MHC-II低/低F4/80低细胞，单核细胞衍生的"不成熟"细胞，巨噬细胞作为Ly6C高/高MHC-II高/高F4/80高/高细胞，常驻/成熟巨噬细胞（即Kupffer细胞/"成熟的"单核细胞衍生的巨噬细胞） Ly6C ^neg/low MHC-II ^高 F4/80 ^{高细胞，将单核细胞巡逻 Ly6C ^{neg/low MHC-II ^{neg F4/80 ^{低细胞和嗜酸性粒细胞鉴定了Ly6C MHC-II ^{neg F4/80 ^低表达（图3B）。的注意，基于其SiglecF确认嗜酸性粒细胞的身份表达和高SSC。
  
  图2.代表性的FACS门控不同肝制剂的策略（全肝悬液， Lymphoprep上部分，Lymphoprep下部分，Percoll下部分级分和Percoll上级分）。（上）选择寿命门基于SSC-A对FSC-A图。（下）选择单细胞，在CD45对FSC图中选择CD45 ⁺细胞
  
  图3。在CD45 +部分内骨髓细胞的代表性门控策略。A.在Ly6G中绘制CD45 sup + +细胞（参见图2，下图）相对于CD11b图，以鉴定PMN（CD11b pos pos Ly6G pos pos ），单核细胞（CD11b pos Ly6G ^{neg ）和CD11b neg Ly6G ^{neg细胞（T细胞，NK细胞， B细胞）。 B.将剩余的CD11b ^{pos Ly6G ^{neg 级分绘制在 MHC-II对Ly6C图以允许鉴定单核细胞（Ly6C高 - > MHC-II ^neg），单核细胞衍生的"未成熟"巨噬细胞（Ly6C高 - 高MHC-II高 - ），"驻留/成熟"巨噬细胞（库普弗细胞，Ly6C ^{neg/low high}），巡逻单核细胞（Ly6C ^low/neg MHC-II ^neg）和嗜酸性粒细胞（EO，Ly6C MHC-II ^neg）。 C.炎症单核细胞的F4/80图（黑色），巡逻单核细胞（蓝色），单核细胞衍生的"不成熟" 巨噬细胞（绿色）和"驻留/成熟"巨噬细胞（橙色）。}}}}}}}}}}

食谱

肝消化介质
1ml胶原酶III型原液：6,000U/ml）稀释于50ml无钙或镁的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中。
分装胶原酶III型（1ml /管）的储备溶液并在-20℃下冷冻可选：如果不需要肝细胞，向培养基中加入10单位/ml的DNA酶I。
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
8g/L NaCl
0.2 g/L KCl
0.24g/L KH 2 PO 4 sub/
1.8g/L Na 2 HPO 4+ 2H 2 O O
加入蒸馏水至1升，用HCl（储备溶液37％）调节pH值为7.4
33％Percoll工作溶液
将PBS加入16.5ml Percoll 储备溶液中，直至最终体积达到终体积为
红细胞裂解缓冲液
8.29g/L NH 4 Cl/h 1 g/L KHCO 3
37.2mg/L EDTA
加入蒸馏水至1升，用HCl调至pH 7.2
MACS缓冲区
不含钙或镁或酚红的HBSS 2％（v/v）热灭活的胎牛血清（FBS） 3 mM EDTA
细胞悬浮培养基
RPMI
5％（v/v）热灭活的胎牛血清（FBS）
封锁媒介
不含钙或镁或酚红的HBSS 2％（v/v）热灭活的FBS 5 mM EDTA
完成媒介
罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）-1640
10％（v/v）热灭活的胎牛血清（FBS） 300μg/ml L-谷氨酰胺 100 U/ml青霉素
100μg/ml链霉素 0.02mMβ-巯基乙醇 1mM丙酮酸钠 1 mM非必需氨基酸
台盼蓝工作溶液
在PBS中制备1％v/v台盼蓝溶液，并以1/10比例使用（细胞/台盼蓝）

致谢

我们承认国际大学吸引人计划（PAI-IAP N. P7/41， http://www.belspo.be/belspo/iap/index_en.stm ）和来自FWO的授权（KaN 1511812N）。 Benoit Stijlemans是由VUB/SRP针对与传染病和癌症相关的炎症（纳米抗体健康）支持的研究员。作者还感谢Ella Omasta，Marie-Therese Detobel，Maria Slazak，Victor Orimoloye和Nadia Abou的技术援助。我们还要感谢Carl De Trez博士的建设性讨论。

参考文献

Ginhoux，F.和Jung，S。（2014）。单核细胞和巨噬细胞：发育途径和组织内环境稳定。 Nat Rev Immunol 14（6）：392-404。
Jenne，C.N.和Kubes，P。（2013）。肝脏的免疫监视。 14 Nat Immunol 14 10）：996-1006。
Pellicoro，A.，Ramachandran，P.，Iredale，J.P。和Fallowfield，J.A。（2014）。肝纤维化和修复：实体器官中伤口愈合的免疫调节。 Nat Rev Immunol 14（3）：181-194。

Sica，A.，Invernizzi，P。和Mantovani，A。（2014）。巨噬细胞在肝脏动态平衡和病理学中的可塑性和极化。肝病学 59（5）：2034-2042。
Stijlemans，B.，Leng，L.，Brys，L.，Sparkes，A.，Vansintjan，L.，Caljon，G.，Raes，G.，Van Den Abbeele，J.，Van Ginderachter，JA，Beschin，A 。，Bucala，R。和De Baetselier，P。（2014）。 MIF有助于
相关的免疫致病性发展。 em> PLoS Pathog 10（9）：e1004414。
Tacke，F。和Zimmermann，H.W。（2014）。肝损伤和纤维化中的巨噬细胞异质性。 Hepatol 60（5）：1090-1096