材料和试剂

Huh-7.5.1细胞系（由美国Scripps研究所的Francis Chisari博士友情提供）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Corning，Cellgro ，目录号：10-017-CV）
胎牛血清（FBS）（Omega Scientific，目录号：FB-11）
100x非必需氨基酸溶液（Life Technologies，目录号：11140050）
1 M HEPES（Life Technologies，目录号：15630080）
100x青霉素 - 链霉素 - 谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：10378016）
补充有EDTA的10×胰蛋白酶（Life Technologies，Gibco ，目录号：15400054）
基于J6/JFH1病毒的嵌合序列合成携带HCV病毒基因组的质粒（pFNX-HCV）
注意：在本协议中，我们以HCV NS5A突变体文库为例，描述相对适合度测定的程序（Qi et al。，2014）。突变病毒文库，其中感兴趣的每个密码子分别用'NNK'取代，其中N表示A/T/G/C的随机掺入; K表示T/G的随机并入。因此，随机密码子包括32个核苷酸组合，涵盖所有可能的氨基酸。
100％乙醇（Decon Labs，目录号：2701）
用于病毒RNA纯化的QIAamp病毒RNA小试剂盒（QIAGEN，目录号：52906）
无菌，无RNA酶的移液管吸头（带有防止交叉污染的气溶胶屏障）（OLYMPUS，目录号：24-401,24-404,24-412，24-430）
SuperScript TM反转录酶试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：18080-044）
RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：10777-019）
KOD热启动DNA聚合酶试剂盒（Novagen ，目录号：71086-4）
PureLink快速PCR纯化试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：K3100-02）
T4多核苷酸激酶（PNK）（New England Biolabs，目录号：M0201S）
NEB缓冲液2（New England Biolabs，目录号：B7002S）
dATP（100mM）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：10216-018）
Klenow片段（3'至5'外切酶）（New England Biolabs，目录号：M0212S）
T4 DNA连接酶试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：15224-017）

设备

15cm细胞培养皿（Genesee Scientific，目录号：25-203）
T-150细胞培养瓶（Genesee Scientific，目录号：25-211）
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
1.7ml微量管（1.5ml）（Genesee Scientific，目录号：22-282）
Falcon 50ml管（Corning，目录号：14-432-22）
Falcon 15ml管（Corning，目录号：05-527-90）
微量离心机（转子用于1.5ml和2ml管）（Eppendorf，型号：5424）
离心机（使用转子用于15ml和50ml Falcon管）（Thermo Fisher Scientific，Legend RT）
NanoDrop ND-1000紫外分光光度计（Thermo Fisher Scientific）
热循环仪（Eppendorf，目录号：950030050）

程序

通过突变病毒库（池1）在Huh-7.5.1细胞中进行选择
1. 种子Huh-7.5.1细胞在50％汇合的T-150细胞培养瓶中（在24ml完全生长培养基中约400万个细胞）
2. 使用巴斯德吸管在烧瓶中生长培养基并感染具有在M.O.I = 0.1的突变HCV文库的单层细胞[病毒库应该如前所述提前滴定 Arumugaswami等人（2008）]。
3. 在37℃下孵育细胞孵育6小时。吸出旧的介质，并把24毫升新鲜完整生长培养基（含有10％FBS，1x NEAA和1x的DMEM）青霉素/链霉素/谷氨酰胺）
4. 孵化被感染的病毒细胞在37℃下72小时，然后Huh7.5.1细胞达到100％汇合（约8百万个单元格）。
5. 收集上清液在50毫升Falcon管。
6. 用1×PBS清洗细胞一次。
7. 胰蛋白酶消化细胞用2毫升1×胰蛋白酶在室温下1分钟，并轻敲烧瓶以完全松开细胞。
8. 通过加入24ml如步骤A3中所述的完全生长培养基停止胰蛋白酶
9. 将细胞以8ml /瓶分配到3个新烧瓶中。
10. 将来自步骤A5的8ml收集的上清液分配到每个中，并加入8ml新鲜的完全生长培养基每个烧瓶达到24ml /瓶
11. 在病毒感染的细胞达到100％汇合之前，在37℃孵育72小时
12. 收集上清液（感染后144小时），并储存为文库泳池2.
13. 滴定池2中的病毒滴度。
14. 重复步骤A1到A13，通过池2并收集池3.
15. 重复步骤A1到A13，通过池3并收集池4.
16. 重复从A1到A13的步骤，通过池4并收集池5。

确定每个突变病毒在每个通道的频率

从每个池（池1至池5）提取HCV基因组RNA QIAamp病毒RNA小型试剂盒，用于从QIAGEN纯化病毒RNA。所有的在该步骤中使用的试剂全部来自该试剂盒，如果不是其他
1. 将每个病毒池的上清液以1500×g离心10分钟以除去细胞相关的可能的污染物 RNA。
2. 取每个样品中的1.4ml上清液在15ml Falcon管中
3. 用5.6ml含有1μg/ml的裂解缓冲液（AVL）裂解病毒的载体RNA（每个样品5.6μg的总载体RNA，以避免过载的柱）通过脉冲涡旋15秒并在室温下孵育温度10分钟
4. 向样品中加入5.6ml乙醇（100％），并通过脉冲涡旋混合15秒
5. 将630μl来自步骤4的溶液转移到QIAamp Mini 柱（在2ml收集管中）。关闭盖子并离心机 6,000×g 1分钟，弃去收集的滤液管
6. 重复步骤5，直到所有裂解物步骤4装载到离心柱上
7. 将500μl缓冲液AW1加入到QIAamp Mini柱上，并以6,000×g离心1分钟。
8. 将QIAamp迷你柱放在干净的2ml收集管中，弃去滤液
9. 加入500μl缓冲液AW2并以20,000×g离心1分钟。弃去收集管中收集的滤液。
10. 以全速（20,000×g）离心2分钟以完全干燥柱。
11. 将QIAamp Mini柱放在干净的1.5 ml Eppendorf管中，加入60μl缓冲液AVE到柱的过滤器区域。关闭盖子并在室温下孵育1分钟。全速旋转（20000 x g ）1分钟以洗脱RNA。
逆转录反应和用于测序的靶区域的PCR扩增。我们用来自Life Technologies的SuperScript ^TM III Reverse Transcriptase试剂盒如果没有另外说明，所有试剂均来自试剂盒
1. 组用20μl逆转录反应与10μlRNA分离每个池（池1-5）和输入RNA文库（池0）以重构Qi等人（2014）所提及的突变病毒文库。将以下组分添加到无核酸酶的Eppendorf管中：
  
  从每个池中分离的RNA
  10微升
  
  随机引物（100 ng/ul）
  1微升
  
  dNTP（10mM） 1微升
  
  H sub 2 O
  1微升
  
  总计
  13微升
2. 将混合物在65℃孵育5分钟，并在冰上孵育1分钟
3. 向下旋转管5秒，并添加以下组件：
  
  RNA混合物
  13微升
  
  5x First-Strand Buffer
  4微升
  
  0.1 M DTT
  1微升
  
  RNaseOUT核糖核酸酶抑制剂
  1微升
  
  SuperScript III RT
  1微升
  
  总计
  20微升
4. 在25℃孵育5分钟，在50℃孵育60分钟
5. 通过在70℃下加热15分钟使反应失活
6. 使用Q-PCR确定每个池中的病毒基因组拷贝数一对HCV特异性引物如下（Arumugaswami等人，2008）：
  引物前向：AGA GCC ATA GTG GTC TGC G
  Primer_reverse：CTT TCG CAA CCC AAC GCT AC
7. 使用KOD DNA聚合酶进行PCR扩增靶区域 "刚好足够的"循环数（基于步骤2f中的Q-PCR反应）至达到饱和。例如，我们将使用28个PCR扩增循环在该步骤如果30个循环将使反应饱和 Q-PCR结果。
8. 用每个PCR反应纯化PCR扩增子 PCR纯化试剂盒，并测量每个样品的浓度用NanoDrop ND-1000分光光度计测定。

构建Illumina测序的测序样品

取1μg来自每个样品的每个PCR扩增子产物并建立与T4多核苷酸激酶（PNK）加入以下反应 5'-磷酸转移至扩增子以允许随后的连接

PCR扩增子
5-17μl（共1μg）

T4 PNK反应缓冲液
2微升

T4 PNK
1微升

H sub 2 O
0-12微升

总计
20微升
在37°C孵育1小时，并用PCR纯化柱纯化样品在40μl
具有Klenow片段（3'→5'外切）的dA尾部：

PCR扩增子
37μl

NEB缓冲区2（10x）
5微升

dATP（1mM）
5微升

Klenow片段（3'至5'外切）
3微升

总计
50微升
在37℃孵育30分钟，并用35μl体积的PCR纯化柱纯化DNA样品

用带有指定不同池的各种条形码的Illumina测序适配器连接：

PCR扩增子	30微升
T4 DNA连接酶反应缓冲液（10x）	5微升
带条码的适配器（10uM）	5微升
T4 DNA连接酶	2微升
无菌H 2 O 2/b	8微升
总计	50微升

通过退火两个寡核苷酸：
产生适配子 5'-ACA CT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC TNN NT-3'5' -/5Phos/NNN AGA TCG GAA GAG CGG TTC AGC AGG AAT GCC GAG-3'。的位置用于区分不同样品的多重ID被加下划线。 NNN 表示多路复用ID的不同序列

在25°C（室温）孵育1小时，并用30μl体积的PCR纯化柱纯化
使用引物通过最终PCR富集衔接子连接的产物：
5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC-3' 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCT CGG CAT TCC TGC TGA ACC-3'。
用30μl体积的PCR纯化柱纯化DNA 用NanoDrop ND-1000分光光度计测量浓度
将500ng来自每个池的最终产物混合并进行Illumina测序（HiSeq）。

确定每个突变病毒在每次传代的频率，并用回归分析计算每个突变病毒的相对适合度评分。
1. 在HiSeq数据文件中读取的每个对端序列被映射到参考序列一旦它通过质量控制（切断35）。每来自参考序列的错配匹配将被鉴定为突变并计数每个突变的数目。剧本 "mapping.txt"用于提供变量映射，此处。
2. 计算在池#N（fv，N）中的给定变量v的频率和频率在池#N（ wt，N ）中的WT wt >
  （池＃N中给定变体的频率）
  
  （池＃N中WT病毒的频率）
  在读取 _v时，N表示变体的序列读取数（）在池#N中读取的序列读数的数目，在池#N中，并且读取 _N表示池#N中的总读数。
3. 丢弃任何低于0.0005的频率，因为突变 HCV的频率为每个约10个核苷酸置换至约10个核苷酸置换核苷酸/轮基因组复制
4. 计算每个突变病毒的相对适合度评分。相对健康得分作为斜率的反对数确定给定变体（W sub）的回归使用在Python中实现的以下公式：
  
  其中ln 是给定值的相对频率的对数变体（v），用于输入RNA文库，池0 重建突变病毒库。脚本'fitness_reg.txt'为将提供此处的健身计算。

代表数据

图1.突变体文库构建和选择的程序。 A.显示HCV NS5A亚结构域中饱和突变文库构建的示意图。将突变的区域分成5个小区域，每个区域由17或18个氨基酸组成。每个残基用一个随机密码子（N 1 N N 2 K：N1和N2代码用于A/T/G/C和K代码用于T/G）代替，并入HCV的WT背景中。 B.然后通过使Huh5.7.1细胞通过4轮来体外选择所得的病毒文库。

图2.预期数据的示例：NS5A中氨基酸18-103在病毒复制中的适应度图。这是显示表示为选择系数的相对适合度分数的热图（）。颜色表示相对于WT（材料和方法）计算为'em's '的每个突变体的适合度。红色表示正的 '（增加的适应度），而蓝色表示负的。 s = 0表示与WT病毒相同的适合度。突变区的二级结构注释在图下方（空心圆：溶剂暴露的残基;实心圆：隐藏的残基;半填充的圆：部分掩埋的残基）。该图由MATLAB软件生成。

笔记

在Huh-7.5.1细胞中突变体病毒文库传代以进行体外选择的过程中，应估计文库复杂性，并且在整个过程中始终维持文库复杂性。库的复杂性可以根据构建库的方式来估计。例如，在我们最近的Qi等人（2014）的研究中，我们将NS5A区域（从aa 18到aa 103）中的每个86位置用所有可能的20个氨基酸加上终止密码子。在这种情况下，文库复杂性可以计算为：86×20（19个变体加终止密码子）+ 1（WT）= 1721。根据我们的经验，我们发现覆盖每个变体至少100x平均给出最佳和可重现的结果
应该选择图书馆进行多轮回归分析，以在计算相对适合度分数时给出更高的置信度

致谢

这项工作得到以下资助：中国国家自然科学基金（NSFC）81172314，国家科学基金会EF-0928690（JLS）和国家卫生研究所AI078133（RS），Margaret E.早期医学研究信托基金，P30CA016042（Jonson综合癌症中心）和P30AI028697（UCLA艾滋病研究所/CFAR）。 JLS非常感谢De Logi主席在生物科学领域的支持和RAPIDD计划的科学与技术。美国国土安全部技术局和Fogarty国际中心，国立卫生研究院。 C.A.O.由NCI癌症教育奖学金，R25 CA 098010支持。

参考文献

在一些实施方案中，本发明的化合物可以用于制备本发明的化合物，其中所述化合物具有下式：其中R 1，R 2，R 3，R 4， SY，Al-Mawsawi，LQ，Wu，TT，Chen，SH，Lin，CY，Zhong，W.，Lloyd-Smith，JO和Sun，定量高分辨率遗传图谱可快速识别丙型肝炎病毒适应性和药物敏感性的序列决定因素。/a> PLoS Pathog 10（4）：e1004064。
Wu，N. C.，Young，A.P.，Al-Mawsawi，L.Q.，Olson，C.A.，Feng，J.，Qi，H.，Luan，H. H.，Li，X.，Wu，T.T.and Sun，高通量鉴定A型流感病毒中抗干扰素活性的功能丧失突变NS segment。 J Virol 88（17）：10157-10164。
Wu，NC，Young，AP，Al-Mawsawi，LQ，Olson，CA，Feng，J.，Qi，H.，Chen，SH，Lu，IH，Lin，CY，Chin，RG，Luan，HH，Nguyen， N.，Nelson，SF，Li，X.，Wu，TT和Sun，R。（2014）。以单核苷酸分辨率高流量分析甲型流感病毒血凝素基因。 em> Sci Rep 4：4942.
Arumugaswami，V.，Remenyi，R.，Kanagavel，V.，Sue，E.Y.，Ngoc Ho，T.，Liu，C.，Fontanes，V.，Dasgupta，A.and Sun，R。（2008）。丙型肝炎病毒基因组的高分辨率功能分析 /em> 4（10）：e1000182。