材料和试剂

青蒿从4周龄无菌幼苗叶子中分离
根瘤土壤杆菌（根瘤土壤杆菌）菌株EHA105（或LBA4404）
溶菌酶培养基（LB）培养基（pH7.0，含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素）
Murashige和Skoog培养基（MS）液体培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M5524）
100μM乙酰丁香酮（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）
10mM MgCl 2/
0.005％Silwet L-77（Agri-Turf Supplies，目录号：VIS-01）
甘油
滤纸（Lab Depot，目录号：TLDCFP1-032）
酵母提取液（YEB）培养基（见配方）

设备

真空泵（Barnant，型号：400-1903）
干燥器（Ted Pella，目录号：2246）
锥形瓶（VWR International，目录号：89095-266）

程序

甘油储备液。将含有植物表达载体构建体的根瘤土壤杆菌菌株EHA105（或LBA4404）解冻，然后在固体LB培养基上划线48小时（pH 7.0，含有50mg/L利福平和载体相应的抗生素例如50mg/L卡那霉素），然后将单个单菌落接种到5ml含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的液体YEB培养基中。
将这些培养物在28℃/200rpm振荡下生长过夜。随后的100ml培养物用1ml前面的5ml过夜（10-12h）培养物接种，并再次在28℃/200rpm下摇动孵育直到OD 600 = 0.5。
通过在4℃下以6000xg离心5分钟收获细菌细胞，并用10ml含有10mM MgCl 2和100μM乙酰丁香酮的洗涤溶液洗涤一次。在4℃下以6,000×g离心另外5分钟后，将细菌细胞沉淀重悬浮于50ml液体MS培养基中。
种子灭菌，发芽和生长。将青蒿种子在无菌Eppendorf管中在1ml 70％乙醇中处理1分钟。涡旋该管，然后除去乙醇。随后将种子用无菌H 2 O洗涤四次。然后将这些表面灭菌的种子在无菌Eppendorf管中使用10％clorox处理10分钟，在此期间将管涡旋至少5次。然后除去Clorox，用无菌H 2 O洗涤种子四次。将灭菌的种子放在植物琼脂固化的MS培养基上，然后置于具有必要光周期和温度的培养箱中。
在培养4周后（图1），选择第7和第8个节间的叶，并且将远离茎的叶的叶柄切开，然后用50ml的枸杞子浸泡的含有A的MS液体介质。在100ml无菌锥形瓶中用补充有0.005％（v/v;即50μl/L）表面活性剂Silwet L-77的根瘤细胞接种锥形瓶，然后用锥形瓶防止污染，放置在干燥器中，并在真空泵的控制下在30英寸Hg下真空10分钟。同时切下和抽真空30多片叶子。然后关闭真空泵，并且将空气缓慢地放入干燥器中，以使对组织的损害最小化。

图1. 艾蒿青蒿 4周龄无菌幼苗的叶片用于瞬时表达，7号和8号选择节间，并且在它们用于瞬时转化
之前切割远离茎的叶的叶柄
将叶子用无菌H 2 O洗涤三次，然后使用无菌滤纸除去液体培养基，将外植体铺在MS固体培养基上用于无菌培养。通常，当靶基因与GUS 或 GFP 标签融合时（图2），共培养时间取决于靶基因表达效率， - 在25℃黑暗中培养36-72小时。

图2.通过瞬时转化使用青蒿叶进行GUS染色

食谱

酵母提取物肉汤（YEB）培养基
5g/L牛肉提取物
1g/L酵母提取物
5 g/L蛋白胨
5g/L蔗糖 0.5g/L MgCl 2·h/v

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金（61173098，No. 61379081）的支持。

参考文献

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