材料和试剂

样品收集和DNA提取
1. Catch-所有样品收集拭子（Epicentre，目录号：QEC89100）
2. MasterPure酵母DNA纯化试剂盒（Epicentre，目录号：MPY80200）
3. 酵母细胞裂解缓冲液（Epicentre，目录号：MPY80200）
4. ReadyLyse（Epicentre，目录号：R1810M）
5. Promega DNA IQ旋转篮（Promega Corporation，目录号：U1221）
6. 不锈钢珠，5mm（QIAGEN，目录号：69989）
7. MoBio PCR水（MoBio，目录号：17000-10）
8. 100％（200标准）乙醇（Warner-Graham公司，目录号：64-17-5）
9. 由350ml 100％乙醇和150ml MoBio水制成的70％乙醇
10. PureLink Genomic DNA Mini Kit（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：K182002）}
PCR扩增
1. Accuprime Taq聚合酶HiFi（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：12346-086）
2. 带指定条形码的正向和反向引物（IDT自定义顺序）
3. MinElute PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28006）
4. QuantIT ds DNA测定，高灵敏度（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：P7589）
5. Ampure（SPRI）珠，60ml试剂盒（Agencourt，目录号：A63881）
6. TE（pH8.0）（Life Technologies，目录号：AM9849）

设备

2.0ml Safe-Lock Biopur单独密封管（Eppendorf，目录号：0030121.597）
无菌剪刀（VWR，目录号：82027-594）
无菌镊子（VWR，目录号：231-SA-SE）
安全锁定PCR Biopur管（Eppendorf，目录号：0030123.344）
15和50ml锥形管（Falcon，目录号：14-959-49D和14-432-22）
96孔热循环板（USA Scientific，目录号：1402-9596）
透明粘性板密封件（美国科学，目录号：2978-2100）
箔板密封（美国科学，目录号：2923-0110）
试剂库（USA Scientific，目录号：2320-2620）
加热震动块，装有Eppendorf管（Eppendorf Thermomixer C）
Bead beater（Qiagen TissueLyser II，目录号：85300）
珠子搅拌器适配器（Qiagen TissueLyser Adapter Sets，目录号：69982）
UV交联剂（UVP，目录号：CL-1000）
微量离心机（Eppendorf，Centrifuge 5415D）
热循环仪（Applied Biosystems Veriti）
板式离心机（Beckman Coulter，Allegra 6KR）
荧光计读板仪（Thermo Scientific，目录号：5210450）
多通道移液器（指定PCR前和PCR后）
用于基于荧光的测定的96孔微量培养板（Life Technologies，目录号：M33089）
Qubit 2.0荧光计（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：Q32866）
Qubit 2.0定量起始试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：Q32871）

程序

样品收集
1. 加入100微升酵母细胞裂解缓冲液到2毫升安全锁管。
2. 打开拭子包，预先润湿拭子在裂解缓冲液，然后拭拭用拭子选择皮肤部位10秒。用于高分辨率皮肤取样，擦拭4cm 2皮肤区域。然后将棉签返回至裂解缓冲液和用无菌剪刀，切掉拭子，使顶部甚至与拭子茎，使其将适合在管中。如果是棉签切割太短，DNA提取步骤中的回收更多难。通过挥动预湿润的拭子收集阴性对照空气，然后放入裂解缓冲液
3. 裂解中的样品缓冲液可以在加工前储存在-80℃。虽然它是未知的无论样品是否稳定，已经获得了良好的结果从冷冻几年的样品。
DNA提取
1. 清洁工作台并用70％乙醇和10％漂白剂离心。紫外线处理移液器和管架使用前30分钟。
2. 在37℃下在加热的振荡块上解冻管子10分钟
3. 短离心管，然后打开，加入1μlReadyLyse和250μl酵母细胞裂解液
4. 孵育管在37℃下60分钟在加热的摇动块
5. 在此期间，UV处理30分钟适当数量 Promega IQ旋转篮和不锈钢珠，例如将它们放置在无菌的覆盖的培养皿中。也UV处理一对镊子。
6. 孵育后，短旋转管。
7. 拿起a Promega篮子用镊子一只手，用另一只手打开一根管子。用另一只手拿着篮子，然后用镊子拿起棉签的尖端。拿着棉签，把篮子放进去管，然后将拭子更换为管+篮。在样品之间，擦拭镊子用70％乙醇浸泡的纸巾
8. 将开放管+篮+棉签放入离心机，短暂旋转收集多余的缓冲液。取出篮+棉签并丢弃。
9. 与镊子用70％乙醇擦拭，打开管子，加入两个5毫米不锈钢珠对每个样品小心不要触摸镊子到管。关闭管和加载管到QIAGEN珠搅拌器适配器和平衡。在30 Hz下打2分钟。
10. 移除管并在65℃在加热的振荡块上孵育30分钟。
11. 置于冰上5分钟。短旋管。
12. 加入150μlEpicenter MPC试剂。涡旋管10秒，然后旋转10 min。同时，标记一套新鲜的2毫升Eppendorf管。
13. 转移上清液，小心不要打扰沉淀管的底部，到新鲜管并加入等体积 100％EtOH。混合反转几次。
14. 设置PureLink 基因组DNA Mini Kit基因组DNA提取柱及其收集管根据制造商的说明。应用样品到萃取柱。以最大速度旋转1分钟。去掉流过，如果样品残留则重复。将柱子放入新鲜收集管。
15. 用500μlBuffer 1洗柱，旋转最大速度1分钟，丢弃流过，并将柱放入a 新鲜采集管。
16. 用500μl缓冲液洗涤柱2.旋转最大速度1分钟，丢弃流过，然后最大旋转速度3分钟以干燥色谱柱。
17. 丢弃流通和放置在干净的安全锁定PCR管中。加入25μl超纯水并静置3分钟。旋转在最大速度30秒洗脱。弃去色谱柱，在-20°C下保存洗脱液。
18. 结果基因组通常根据制造商的说明书来定量DNA 与Qubit荧光定量。无论浓度，2微升每个样品用于随后的扩增。

用于454测序的V1-V3区域的16S扩增

这里，使用每个反应2μl洗脱液，并进行反应一式两份并在纯化前合并。浓度洗脱液是高度可变的，取决于样品来源。例如，低丰度的皮肤部位可以产生低于1ng /μl，而高丰度皮肤部位可产生大于50ng /μl 引物V1_27F：5'-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3'
引物V3_534R w /条形码：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'
可以在 http://www.hmpdacc.org上在线获取其他地区的入门指南和示例条码。

为了产生两个96孔板的预混合物，组合缓冲液，Taq，正向引物和水倒入15ml锥形管中并涡旋混合。保持在冰上。所有量以μl计。

	1反应	110x反应
10x Accuprime缓冲区II	2	220
Accuprime taq	0.15	16.5
100μMPrimer V1_27F	0.05	2.2
带有条形码的2μMPrimer V3_534R	2	-
DNA洗脱液	2	-
水（用于PCR）	13.8	1519.1

等分23微升预混到两个96孔板的每个孔。
向每个孔中加入条形码反向引物。
向每个孔中加入DNA。
密封板用thermofoil，并向下旋转。
运行以下PCR程序：
95℃，2分钟
30个循环：
95°C，20秒
56℃，30秒
72℃，5分钟
然后，
4°C，永远

用于454测序的ITS1扩增

这里，使用每个反应4μl洗脱液，并且一式两份进行反应，并在纯化前合并。
引物ITS1F：5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGGTAAAAG TCGTAACAAGGTTTC-3'
带有条形码的引物ITS1R：5'-GTTCAAAGAYTCGATGATTCAC-3'

为了产生两个96孔板的预混合物，组合缓冲液，Taq，正向引物和水倒入15ml锥形管中并涡旋混合。保持在冰上。所有量以μl计。

	1反应	110x反应
10x Accuprime缓冲区II	2.5	275
Accuprime taq	0.2	22
100μM引物ITSF	0.1	11
水（用于PCR）	16.2	2002

2μM带条形码的引物ITS1R	2	-
DNA洗脱液	4	-

等分19μl预混合到两个96孔板的每个孔。
向每个孔中加入条形码反向引物。
向每个孔中加入DNA。
密封板用铝箔密封，并向下旋转。
运行以下PCR程序：
95℃，2分钟
32个循环：
95℃，30秒
50℃，30秒
72℃，2分钟
然后，
72℃，5分钟
4°C，永远

用Agencourt SPRI试剂盒进行PCR清洗
1. 旋转板，然后将V1-V3反应合并成一个板，将ITS反应合并成一个板
2. 每孔加入72μlAgencourt珠，上下移动10x
3. 在室温下孵育5分钟以将DNA结合到珠子上
4. 将板放在磁铁上2分钟，以从溶液中分离珠子
5. 保持板在磁铁上，吸出清除溶液反应板（注意避免吸液珠底部井），并丢弃
6. 保持板在磁铁上，添加200微升70％乙醇的每个孔。吸出。重复。
7. 保持板开放5分钟干珠。
8. 从磁铁上取下板，加入25μlTE，pH 8.0的板。允许洗脱1分钟。
9. 将板放回磁铁，让珠子分开1分钟。
10. 将洗脱液转移至新平板。
使用QuantIT dsDNA高灵敏度测定试剂盒进行PCR产物定量
1. 将套件部件的温度升至室温。
2. 对于两个板，在50ml锥形管中混合40ml的QuantIT缓冲液与200μl的QuantIT试剂。
3. 等分200微升缓冲试剂混合物到两个96孔微量培养板的每个孔用于基于荧光的测定
4. 从试剂盒中添加10μl的每个标准品（8总标准在0， 0.5，1，2，4，6，8和10 ng /μl）。标准重复读取，并单次采样。
5. 向孔中加入2μlPCR产物，在标准品和样品之间留下一列空白。
6. 包括10秒振荡步骤，在具有过滤器对485/538的Thermo板读数器上测量荧光。
7. 从标准生成标准曲线，减去背景。
8. 从标准曲线和方程计算PCR产物浓度。
PCR产物合并和纯化
1. 将大约等量的每种PCR产物合并成单个 Eppendorf管。每个样品的目标ng由最低确定浓度样品（不含对照）。对于最低浓度样品，添加整个PCR产物，以及对于具有更高的PCR产物金额，添加大致相等的金额。
2. 净化池用QIAGEN minElute柱根据制造商的说明书。简言之，向1体积的组合PCR中加入5体积的缓冲液PB 池。
3. 将样品应用于已置于2 ml收集管中的MinElute色谱柱。
4. 为了结合DNA，以最大速度离心30秒。弃去流出物并将柱放回同一管中。
5. 用750μl缓冲液PE洗涤，弃去流出液，然后离心1分钟
6. 将柱置于新管中，并在30μlTE（pH 8.0）中洗脱。该最终产物表示近似相等的浓度的96个输入样本中的每一个。为了确保质量，可以然后根据制造商的说明定量合并的文库用Qubit荧光定量，或通过在2μl上运行电泳琼脂糖凝胶或等同物。对于V1-V3扩增子，产品尺寸应在450-550 bp之间。
7. 单人，合租然后可以将Eppendorf管中的扩增子文库发送至用于在454GS FLX上测序的测序装置（Roche， http://454.com /products/gs-flx-system/index.asp ）仪器使用钛化学。

代表数据

对于序列处理，我们建议您使用mothur软件（ http://www.mothur.org ）和454由Pat Schloss（http://www.mothur.org/wiki/454_SOP）编写的标准操作协议：
总之，序列处理的第一目的是将原始454数据去卷积为单个样本，然后去除由于PCR或454测序错误产生的技术伪像导致的质量差的序列。然后序列处理的第二步是使扩增子序列有意义。对于基于16S rRNA扩增子测序的研究，将序列加工成代表细菌或古细菌"物种"的操作分类单位（OTU）。对于基于ITS的真菌研究，我们优选将序列分类为"系统型"，因为作为形成OTU的基础的序列距离对于ITS是非常可变的，其处于与16S rRNA非常不同的选择压力下，取决于真菌分类群。对于感兴趣的物种水平分类，我们使用由Eric Matsen编写的pplacer算法创建了自定义分类参考（ http：//matsen.fhcrc.org/pplacer ）。例如，为了鉴定葡萄球菌序列，属于不同葡萄球菌种的16S全长rRNA序列可以从Genbank或RDP（ http://rdp.cme.msu.edu ）构建系统发育树。使用高质量（例如，型菌株，完全测序的基因组）构建系统发生模型是重要的。

然后我们使用R软件对mothur生成的文件进行后处理。例如，为了生成物种之间的相对丰度的图，我们使用在mothur（图1）中由classify.seqs（）或classify.otu（）命令生成的* .tax.summary文件。在 https://github.com/julia0h/amplicon_bioprotocol.git在plottingTaxonomy /文件夹中

为了检查样本中的α多样性，我们通常使用Shannon多样性指数，Inverse辛普森或从motuur中的summary.single（）命令观察到的物种（图2）。示例脚本在plottingDiversity /中提供。

最后，为了将样本与诸如Yue-Claytonθ索引的距离度量进行比较以生成主坐标分析图，我们使用dist.shared（）和pcoa（）命令的输出（图3）。示例脚本在plottingPCOA /。
中提供

图1.对照组与疾病组的示例相对丰度图

图2.示例alpha多样性分析，看看在3个不同网站的Shannon多样性之间的差异

图3.基于Yue-Claytonθ值的示例原理坐标分析，显示来自不同个体的样本之间的相似性。用线显示对样本之间变化有显着影响的分类。

致谢

该协议基于在Oh等人（2013）中生成和分析的数据。皮肤取样程序由Heidi Kong博士设计，以及由Clayton Deming，Cynthia Ng和Elizabeth Grice在National Institutes of Health设计的DNA提取和扩增程序。

参考文献

Oh，J.，Freeman，A.F.，Program，N.C.S.，Park，M.，Sokolic，R.，Candotti，F.，Holland，S.M.，Segre，J.A.and Kong，H.H。（2013）。原发性免疫缺陷患者人类皮肤微生物组的改变景观 Genome Res 23（12）：2103-2114。

Schloss，PD，Westcott，SL，Ryabin，T.，Hall，JR，Hartmann，M.，Hollister，EB，Lesniewski，RA，Oakley，BB，Parks，DH，Robinson，CJ，Sahl，JW，Stres，，Thallinger，GG，Van Horn，DJ和Weber，CF（2009）。介绍mothur：开源，平台独立，社区支持的软件，用于描述和比较微生物群落。 Appl Environ Microbiol 75（23）：7537-7541。

Schloss，P.D.，Gevers，D.and Westcott，S.L。（2011）。降低PCR扩增和测序工件对基于16S rRNA的研究的影响。 em> PLoS One 6（12）：e27310。

Matsen，F.A.，Kodner，R.B.and Armbrust，E.V。（2010）。 pplacer：序列在固定参考树上的线性时间最大似然和贝叶斯系统发生位置。 a> BMC Bioinformatics 11：538.