材料和试剂

玉米幼苗叶片
氰化钾（KCN）（Sigma-Aldrich，目录号：207810）
水杨酰羟肟酸（SHAM）（Sigma-Aldrich，目录号：S607）
连二亚硫酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：71699）
反应介质缓冲液（参见配方）
0.2 M KCN（参见配方）
0.2 M SHAM（参见配方）

设备

Chlorolab II液相氧电极（Hansatech）
恒温水浴
循环水泵
微量注射器（50μl）

程序

在生长条件下（在22±2℃，16小时光/8小时黑暗光周期和光密度150μmol/m 2/s）在盆栽土壤中培养玉米幼苗，为期2周。
在测量之前，将玉米幼苗在黑暗中保持约2小时，以减少光合作用的影响。
打开恒温水浴，将其温度设置为25°C; 同时，将反应介质缓冲液（约200ml）和循环水泵放入其中
清洁氧电极：将棉签浸入快速电极盘抛光（随设备提供），并用其清洁电极的阳极和阴极（图1A）;然后用蒸馏水清洗电极，并用吸水纸除去表面水

图1.准备电极盘。 A.清洁电极盘。 B.安装电极膜。 C.安装电极盘。
根据说明安装电极膜（图1B）：
1. 将一小滴电解质（半饱和KCl）放在电极盘（阴极）的圆顶上;
2. 放一块1.5厘米宽和3.5厘米长的盐桥纸电解质，并确保至少一个角落在电极中很好地作为灯芯;
3. 用一片电极膜（P.T.F.E膜）覆盖，其对氧分子是选择性可渗透的;
4. 将小O形环放置在电极盘的圆顶上，用施加器工具;
5. 将几滴电解液加入电极槽（阳极）。
  注意：电极膜表面应平滑，无气泡。
安装电极盘（图1C）：垂直握住电极室，将电极放入其中，使膜覆盖的圆顶形成电极室的底板。
氧电极的平衡：将50ml蒸馏水加入烧杯中，并充分搅拌几分钟以充分溶解O 2;将2ml空气饱和的蒸馏水和磁性随动物放入反应室中并启动氧电极;连接循环水泵，使反应室内的温度保持恒定。氧气电极应在校准前平衡约30分钟（图2A）
氧电极的校准：
1. 在反应室中建立"空气管路"。
  连续按 "Calibrate" - "Oxygen" - "New"; 然后输入实际温度和校准窗口中的大气压力按"确定"; 腔室中蒸馏水的氧浓度将实时记录; 当轨迹稳定时，按"停止"。
2. 在反应室中建立"零氧气管线"。
  当屏幕显示"在腔室中建立零氧气"时，添加高浓度的连二亚硫酸钠溶液（制备时使用）用微量进样器注入反应室，然后按"确定"; 在这一次，蒸馏水中的氧气将被钠消耗连二亚硫酸盐当氧浓度几乎降低到零时轨迹稳定，屏幕会再次显示"建立空气管路在房间";丢弃反应室中的溶液并洗涤反应室，盖和磁性随动器蒸馏水反复;然后加入2ml空气饱和的蒸馏水进入腔室，然后按"确定";当轨迹稳定时，按"停止"。校准完成。
  
  图2.呼吸频率测定。 A.氧电极的平衡。 B.把叶子放进去反应室和平衡5分钟。 C.放电极室覆盖并开始记录呼吸率。 D.加入抑制剂微量注射器在测定过程中
在测量期间，将约0.15g玉米幼苗叶切成相同大小的片段（约2mm 2），并在反应介质缓冲液中测量O 2消耗速率在25℃在黑暗中（图2B）。
测量程序：加入2ml反应介质缓冲液并离开反应室;平衡5分钟，然后开始记录O 2消耗2-3分钟;停止记录，并加入20μl0.2 M KCN与微量进样器的反应室，1分钟后，重新开始记录2-3分钟;停止记录并加入20μl0.2M SHAM，2分钟后，重新开始记录2-3分钟。为了避免反应室内的氧限制条件，在O 2达到空气饱和水平的约50至60％（图2C和D）之前终止所有测量。
呼吸速率计算：在实验中，KCN和SHAM分别用于抑制细胞色素氧化酶和替代氧化酶的活性。线粒体总呼吸（TP）定义为在没有任何添加的情况下O 2消耗率。剩余呼吸（RP）定义为在2mM KCN和2mM SHAM存在下的O 2消耗速率。细胞色素途径能力（CP）定义为TP减去在2mM KCN存在下O 2消耗速率的值。替代途径能力定义为TP减去CP和RP（图3）。

图3.呼吸速率的计算。在校准氧电极后，计算机可以实时显示反应室中的实际O 2浓度（Y轴）。因此，呼吸速率可以基于反应室中反应缓冲液的体积，氧浓度的变化，反应时间和叶的鲜重（FW）计算。呼吸速率可以表示为μmolO 2次/min/g FW

食谱

反应介质缓冲液
10 mM HEPES
10 mM MES
2mM CaCl 2 2 / 用KOH调节pH至6.8，
0.2 M KCN
溶于蒸馏水中
0.2 M SHAM
溶于二甲基亚砜（DMSO）中

确认

这项工作得到香港特别行政区研究资助局给予B.C.T.的资助。（项目编号473512和473611），以及中国国家自然科学基金会给B.-C.T.的资助。（项目编号31170298）。

参考文献

中国农业大学学报（自然科学版））。小核1编码线粒体nad7转录本编辑和玉米种子发育所需的pentatricopeptide重复蛋白（< 79（5）：797-809。