材料和试剂

柠檬酸一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：33114）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
（Merck KGaA，目录号：1.06580.1000）。
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：D1306）}
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
鞘液; Iso-Diluent（Beckman Coulter，目录号：NPE 629967）
清洁溶液（Beckman Coulter，目录号：629969）
关闭溶液（Beckman Coulter，目录号：629968）
库存解决方案（参见配方）
Otto 1溶液0.01％（参见配方）
Otto 1溶液1％（见配方）
Otto 1溶液0.5％（参见配方）
Otto 2解决方案（参见配方）

设备

1.2ml团簇管和架（无菌）（Thermo Fischer Scientific，目录号：07-200-320）
存储板盖条（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB-0981）
3mm不锈钢珠（Schieritz& Hauenstein，目录号：22.455.0011）
Nunc多孔深孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：278011）
96孔V型底板（SARSTEDT AG，目录号：82.1583.001）
200μl尖端（SARSTEDT AG，目录号：70.760.002）
1ml吸头（Rainin/Mettler Toledo，目录号：RC-1000/10）
单通道移液器（Gilson，目录号：P10，P1000）
多通道移液器10-100μl（Thermo Fisher Scientific，目录号4661130）
多通道移液器30-300μl（Thermo Fisher Scientific，目录号4661140）
混合机（Retsch，型号：MM300）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
UV灯（13.流式细胞仪的一部分）
流式细胞仪（Beckman Coulter，Cell Lab Quanta SC，序列号：AN020010）
流式细胞仪机器人（Beckman Coulter，MPL，Cell Lab Quanta SC，序列号：AN90022）

程序

通过珠磨（3-4小时）分离细胞核
1. 将单个3毫米不锈钢珠放入每个簇管（图1A）。
2. 将集群管放入96孔架（图1B）。
3. 标记试管并标记试样的位置（如实验室书中的示意图）。
4. 将长角果固定在胶带上，并用夹层将其缝开或皮下注射针（图1C-D）。添加一个成熟但仍为绿色种子（图1C-D）。在 boechera 胚乳种子成熟后降解。如果一个完全成熟的种子的种正在调查含有胚乳，可以使用成熟种子。这可以通过显微镜分析在各种清除的种子阶段。清除的方法取决于物种，应该是根据已公布的协议进行选择和调整
  
  图1。 A.在簇管中有一个3毫米不锈钢珠。 B.在合适的96孔架中含有单珠的簇管。 C.最佳种子阶段为Boechera spp。种子。顶部长角果具有太年轻不能使用的种子（太少的细胞），并且底部长角果在最佳阶段具有种子。 D.顶部长角果具有太老的种子（它们开始变成棕色，与胚乳的降解一致）。下部长角果在最佳阶段具有种子。 E. C.特写镜头D.特写镜头D.线条表示照片的一部分在特写镜头被删除。
5. 每管加入80μl的Otto 1（0.01％）。
6. 使用存储板盖条关闭管。
7. 通过使用混合机在30Hz下振动样品3分钟来粉碎种子。
8. 将板旋转180°并重复步骤A6。手臂的远端部分混合器粉碎机具有比近端部分更大的振幅。车削板补偿了混合器磨机的不同振幅。
9. 控制种子是否通过目视检查破碎。如果溶液变成乳状，则压碎种子（图2）。
  
  图2.粉碎和未粉碎的种子。绿色箭头表示成功破碎的种子和乳状溶液。白色箭头点到非压碎种子。红色箭头显示没有种子的管。如果溶液是澄清的，种子在簇管中可见，它是未压碎，无法测量。
10. 如果不是所有的种子都被压碎，重复步骤A7-9，直到所有的种子被压碎。
11. 摇动溶液以从盖子上除去液滴，通过轻轻地将板平放在桌子上，或通过快速旋转（5 秒）。
12. 每管加入80μl的Otto 1（1％）。小心不要触摸管或泡沫与尖端不交叉污染样品。
13. 关闭管和混合手动倒转40x，避免快速运动产生泡沫。现在体积为160μl，浓度为0.1M柠檬酸和 0.5％Triton X-100
14. 将过滤板放在干净的96孔V型底板上（图3A）
15. 标记板。
16. 将提取的核的溶液转移到烧结的深孔板，通过使用多通道移液管或通过倾倒。小心保持样品的顺序。
17. 在室温（20℃）下以150×g离心5分钟以沉淀细胞核。
18. 小心地从离心机中取出板。颗粒核非常松散
19. 取出多孔深孔板。如果他们彻底洗涤用自来水和去离子水冲洗，可以重复使用
20. 用移液管吸头放置在V的边缘（图3B）除去上清液。
21. 不要快速吸移; 否则核将被吸出。
22. 颗粒应该是白色至浅棕色的外观。
23. 加入30μl的Otto 1（0.5％），以重悬细胞核。添加缓冲液通过快速移液足以重悬细胞核
24. 样品现在可以在4°C储存72小时，直到使用
  
  图3。 A.在96孔V型底板上的烧结深孔板。乙。卡通代表尖端的位置，以去除上清液。
测量DNA含量（倍性）（每个样品约7-8分钟，取决于细胞核的浓度）
1. 启动流式细胞仪和紫外灯。请参考用户手动流式细胞仪或从中获得介绍充电。
2. 当UV灯加热（30分钟）时，将样品置于室温下以平衡（见注释）。
3. 加载或更改检测设置，使二倍体峰为在通道200（相对荧光单位）在线性刻度（见注释）。
4. 手动或使用流式细胞仪的机器人添加160μl的Otto 2溶液
5. 测量样品并记录数据。停止收集数据总计6,000（这需要大约7-8分钟）或之后一定时间（例如 5分钟）。
6. 相应处理所有其他样品。
7. 手动注释峰（见图4-6）。丢弃其中的样品胚乳不能给出清晰的峰！这是必要的看到的高峰胚乳（见注释）。
8. 将数据保存在至少提供样品名称，平均值，中值和方差系数的表中。
分析数据
1. 计算胚乳与胚胎的比例。
2. 如果母本的倍性可用，计算胚胎与母本的比率。

代表数据

图4.二倍体boechera stricta的性后代（n + n）。此直方图显示x轴上的荧光强度和每个强度的计数数y轴。峰根据从内部或外部标准推断的倍性手动注释和标记。绿色代表胚胎的核。 4x和8x峰来自核心重复的胚胎核（自体多倍体化）。棕色代表
胚乳核。 3x：2x峰的比率为275.99/187.4 = 1.47，表明性发育。 6x：4x峰的比率为1.48。使用自动多倍体峰用于比率计算提供了内部控制

图5.三倍体Boechera gunnisoniana的单性生殖后代（2n + 0）。绿色代表胚胎的核。 3x，6x和12x峰表示自体多倍体化。作为apomictic Boechera 通常是假性的（Rushworth等人，2011），我们预期受精胚乳（表1）。在这种情况下，胚乳为9x（9x：3x比率为2.86），表明未还原的精子细胞受精。

图6.三倍体boechera gunnisoniana 的B 混合后代（2n + 2n）。此直方图几乎与图6中所示的直方图相同。然而，红色峰（3x）远小于6x峰，这表明这是来自母体孢子体组织的污染，这是由于从长角果上刮下种子。作为 B。 gunnisoniana 产生未减数的雌性和雄性配子，2n + 2n胚胎峰（6x）将是来自母体核（3x）的大小的两倍。这些数据由Schmidt及其同事（2014）发表。

笔记

较冷的样品显示较高的荧光强度。
使用不同的软件以不同的方式更改设置。软件通常与流式细胞仪一起提供。因此，我们不提供有关所使用软件的详细信息。然而，将该方案适应于新物种或新组织总是首先需要一些优化。请参阅用户手册和/或从仪器负责人那里获得培训。
在添加Otto 2溶液后，染色强度随时间而变化。必须确保从加入Otto 2溶液到测量样品的时间间隔是恒定的，或者一旦染色强度稳定就进行测量。在这里我们描述使用采样机器人的程序，确保从染色到测量的时间间隔是恒定的。
Otto 2与Otto 1溶液的体积比应为约4：1。
根据我们的经验，由于无法鉴别的胚乳峰，25-35％的数据必须被丢弃（图7）。自然人口的材料可以达到45％。
如果将中值用于比率计算（4个独立测量，CV <0.01），则结果显示更高的再现性。
尽可能使用内部标准。内部标准混合到每个单一样品（图8）。对于拟南芥，我们已经成功使用了番茄。圣马尔扎诺，以及 Hieracium pilosella ，我们使用了贝利斯perennis。
选择内标：内标的DNA含量应与样品物种的DNA含量充分不同，以避免标准样品和样品物质之间的重叠倍数峰。值可以在文献中找到。理想地，内标具有比样品更低的DNA含量（总是直方图中非常左的峰），或者比样品物种的任何预期的倍性峰更高的DNA含量（总是直方图的非常正确的峰） br />
如果内部标准不可用，使用外部标准（已知倍性的植物）。外部标准应该是在一个板上的一组样品中测量的第一个和最后一个样品。从已知倍数的外标的位置（峰的中值），可以计算未知样品的倍性。

图7.无法鉴别的胚乳峰

图8.具有内标Solanum的二倍体（A）和三倍体（B）Boechera植物。。红色标记具有比样品更高的DNA含量的内标。因此它在直方图的右手边。

食谱

库存解决方案
1mol/L柠檬酸
饱和的（0.54mol/L，在20℃）Na 2 HPO 4溶液
2 H 2 O溶液
2mg/ml DAPI的水溶液（超纯水，电导率>18MΩ cm <-1> ），
Otto 1溶液0.01％（对于100ml）

0.1mol/L柠檬酸
10ml 1mol/L

0.01％（v/v）Triton X-100 10微升

用水（电导率>18MΩ cm ^-1）填充至总体积为100ml。
Otto 1溶液1％（对于100ml）

0.1mol/L柠檬酸
10ml 1mol/L

1％（v/v）Triton X-100 1000微升

用水（电导率>18MΩ< - > cm <-1> -1 ）填充至总体积为100ml。
Otto 1溶液0.5％（对于100ml）

0.1mol/L柠檬酸
10ml 1mol/L

0.5％（v/v）Triton X-100 500微升

用水（电导率>18MΩ cm ^-1）填充至总体积为100ml。
Otto 2溶液（对于100ml）

0.4mol/L Na 2 HPO 4 sub。 2H 2 O 74.1ml饱和溶液

0.4μg/ml DAPI
200μl2mg/mL储备液

0.2μl/mlβ-巯基乙醇 200μl

用水（电导率>18MΩ< - > cm <-1> -1 ）填充至总体积为100ml。

致谢

该协议基于以前发表的工作（Matzk等人，2000; Schmidt等人，2014）。我们在这方面的研究由苏黎世大学，Marie居里项目IDEAGENA，先正达博士支持。苏黎世 - 巴塞尔植物科学中心的项目，以及"COST行动FA0903"框架下的"StaatssekretariatfürBildung und Forschung"的赠款。我们感谢Manuel Waller帮助流式细胞术，Anja Herrmann和Margarida Sofia Nobre仔细阅读这个协议。

参考文献

Koltunow，A.M.和Grossniklaus，U。（2003）。 Apomixis：发展观点 54：547-574。
Matzk，F.，Meister，A。和Schubert，I。（2000）。使用单子叶植物和双子叶植物的成熟种子进行繁殖途径的有效筛选 Plant J 21（1）：97-108。
Rutishauser，A。（1947）。 Untersuchungenüberdie Genetik der Aposporie bei pseudogamen Potentillen。 Experientia 3（5）：204-205。
Rushworth，CA，Song，BH，Lee，CRand Mitchell-Olds，T。（2011）。 Boechera 一个生态基因组学模型系统。 Mol Ecol 20（23）：4843-4857。

Schmidt，A.，Schmid，M. W.，Klostermeier，U. C.，Qi，W.，Guthorl，D.，Sailer，C.，Waller，M.，Rosenstiel，P.and Grossniklaus，单性生殖和性生殖发育在细胞周期，转录，激素和表观遗传调节方面不同。 a> PLoS Genet 10（7）：e1004476。