材料和试剂

大肠杆菌 OP50（Carolina，目录号155073）
M9（He，2011）
NGM琼脂培养基（He，2011）
M9 500ml + Triton X-10050μl
盐酸二乙胺（Sigma-Aldrich，目录号122564）
喜树碱（Sigma-Aldrich，目录号C9911）
羟基脲（Sigma-Aldrich，目录号H8627）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号T8787）
20％碱性次氯酸盐溶液（参见配方）

设备

24孔板（OLYMPUS，目录号25-102）
短端一次性玻璃巴斯德移液管（VWR International，目录号14673-010）
培养皿（60×15mm）（VWR International，目录号25384-092）
密封膜（Parafilm M，目录号：PM996）
Nutator mixer（Clay Adams，型号：1105 Mixer）
20℃培养箱（Thermo Fisher Scientific，Precision 815）
37℃振荡培养箱（New Brunswick，Innova 4330）
37℃培养箱（（VWR Internationa，1510E））
用于旋转15ml管（Lanmet，Hermle Z，型号：400K）的台式离心机
立体显微镜（Leica Microsystems，型号：MZ75）
UV交联剂（Stratagene，型号：2400 Stratalinker），用254nm UV灯泡
γ-IR照射器（Shepherd& Associates，Mark 1 Cs ¹³⁷照射器）

程序

基因毒素的制备
DNA损伤剂通常是有毒的，在使用它们时需要额外的安全预防措施。穿双手套和实验室外套。始终在层流中工作，并在硬壁坚固的容器中标记和密封容器。制备新鲜的溶液以避免可能的降解，并始终密封管，即使短期储存。必须小心谨慎，以确保所有的废料都得到妥善处理在该方案中，固体/琼脂培养基用于UVC，γ-IR和HU灵敏度测定，而CPT和HN 2处理在液体培养中进行（表1）。减数分裂长期的缺陷通过暴露后26-28小时的分析来解决（Jaramillo-Lambert等人，2010）。有丝分裂修复失败通过暴露后48-72小时的分析进行检查
1. 嘧啶二聚体：可以利用紫外线照射处理 2400 Stratalinker。将蠕虫暴露于0至150J/m 2的UVC。的从培养皿中取出盖子以确保更好的UV渗透。大多数紫外线交联剂内部有一个紫外线传感器，所以必须小心通过将板放置在其旁边来避免阻挡/中断UV传感器。处理后，蜗形板被包裹在箔中以避免电位照片恢复。已知的敏感菌株： slx-1 （ tm2644 ）（Saito 2012）和 him-18 （ tm2181 ）（Saito等人，2012）。
2. DNA双链断裂：评估γ-IR灵敏度，剂量范围在0至150之间 Gy通常使用。查找您的辐射剂量率（Gy/h）以计算曝光时间。已知的敏感菌株： him-18 （ tm2181 ）（Saito ，2012），
  （ tm1145 ）（Ward 等 2007）和 ztf-8 （ tm2176 ）（金和Colaiacovo，2014）。
3. 复制抑制：羟基脲溶于水。完全溶解HU 良好量的水（〜10ml），并将其混合到高压灭菌的NGM琼脂培养基中（1L），当其已经冷却至55-50℃时。 HU是吸湿性的，必须是密封并储存在干燥器中。 HU灵敏度评估将动物置于用OP50（大肠杆菌）接种的NGM平板上，至40mM HU 20小时。已知的敏感菌株： clk-2 （ mn159 ）（Bailly et al。，2010）和 ztf-8 （ tm217 6）（金和Colaiacovo，
4. 单链断裂：喜树碱不溶于水，而是以10mg/ml溶于DMSO。较高的浓度需要热量它完全进入溶液（95℃10分钟）。这是可取的以制备较低的浓度，避免加热有毒物质。的喜树碱的最终浓度范围为0至1,000nM in M9缓冲液中含有OP50。 M9溶液，pH6.0 通过更好的方式提供比pH 7.0更高的灵敏度阻碍拓扑异构酶活性（Kessler和Yanowitz，2014）。已知敏感菌株： him-18 （ tm2181 ）（Saito等人，2012）和 brc-1 tm1145 ）（Ward等人，，2007）。
5. 链间交联：氮芥子（HN 2）可溶于水。对于氮芥（HN 2）在M9缓冲液中用0至150μM的HN 2 S处理动物含OP50。已知的敏感菌株： brc-1 （ tm1145 ）（Ward等人 2007）和 slx-1 （ tm2644 ）（Saito ，2012）。
  表1.已知 DNA损伤敏感菌株的基因毒素。基因毒素，它们产生的损伤，以及敏感菌株。用于此的媒体还指示协议。
蠕虫准备
C。 elegans 菌株在接种OP50 E的NGM平板（60×15mm培养皿）中培养。如在Brenner（1974）中所述的标准条件下在20℃温育大肠杆菌。简言之，制备10ml含NGM琼脂的板，并在用OP50E接种之前在保持在室温的储存箱中干燥4-5天。并在37℃培养箱中放置过夜。 N2 Bristol菌株与表1所述的敏感突变体一起用作野生型对照
日常程序
液体和固体暴露的基本程序是相似的，如图1所示，尽管液体暴露需要在诱变处理之前和之后的额外的洗涤。计算测定所需的蠕虫总数。例如，对于三个剂量的暴露，需要每个基因型约75虫（5虫/板×5板×3剂）。然而，由于一些蠕虫可能会丢失，因为它们倾向于附着到塑料，如移液管尖端和Eppendorf管，并给出潜在的致死率，可能会由于暴露于基因毒素，可能会发生，建议有2倍的蠕虫一般。

图1. DNA损伤灵敏度测定的日常程序的示意图。通过在第1天漂白蠕虫的蛋制备或在第4天手动挑选L4蠕虫来准备同步的年轻成年人。如图所示，液体和固体暴露的基本程序是相似的。注意，液体暴露需要在暴露于诱变剂之前和之后的额外的洗涤。详情请参阅B.日常程序
第1天
1. 为了准备同步的L1阶段幼虫，妊娠成体雌雄同体通过加入1-2ml的M9 /板从板中洗去。离开板与M9 30-60秒以驱逐蠕虫。或者，对于a 小规模试验，L4蠕虫可以用铂丝代替的洗掉板。但是，通过漂白同步会删除潜在的真菌污染的蠕虫，这可能是有问题的时候计数蠕虫。所需的成虫总数可能不同，但40名成年人需要获得〜160 L1幼虫。如果你有同步L4蠕虫准备好测定，跳过此步骤并开始从步骤C10。
2. 使用玻璃巴斯德吸管转移蠕虫 15 ml falcon管。（*短端长度的巴斯德移液器更容易操作。在15ml管上标记300μl管是方便的在步骤C3中使用。）
3. 在秋千桶离心机中旋转蠕虫（在〜1,000rpm或〜210rcf下30-60秒），并除去上清液轻轻吸出M9。留下〜300微升的溶液在底部避免扰动蠕虫丸。
4. 加入3ml 20％碱性次氯酸盐溶液并轻轻旋转试管。大多数蠕虫会破裂打开和释放他们的鸡蛋在〜5分钟。不要漂白太长时间避免杀死鸡蛋。
5. 每管加入〜15 ml M9，倒置几次
6. 重复步骤C3三次以除去碱性次氯酸盐溶液。
7. 向管中加入最多15ml的M9，并在20℃下孵育过夜温和摇动（Nutator mixer）。用石蜡膜密封帽避免泄漏。
第2天
1. 重复步骤C3。
2. 从〜300μl的溶液保留在离心并除去上清液后，将适量的含有L1蠕虫的液体分配到OP50种子盘子。计数蠕虫的数量，并确保不要有许多或没有足够的蠕虫在盘子里。瞄准每个种子〜50蠕虫盘子。如果你从40个妊娠成年人开始，分配50微升到6个种子通过涡旋轻轻混合沉淀后，将板（总共300μl）。在20°C孵育〜48 h，直到蠕虫到达L4幼虫阶段。
第3天
简要监测蠕虫生长。确保蠕虫不饿。
第4天
1. 蠕虫将处于L4阶段。额外孵化18-20小时和年轻成虫会准备进一步分析。一般来说，选择两次每个基因型的每个剂量的蠕虫数。例如，选择150 N2蠕虫的蠕虫三剂（25虫×3剂×2次）
2. 对于在液体介质（CPT和HN 2）中的暴露：接种在20mL的OP50中 LB培养基在50ml锥形管中，并在摇床培养箱中孵育在37℃过夜。注意，20ml培养物足以用于3种基因型（两个对照+样品）与3个剂量的液体中的暴露。
第5天
1. 用于在固体介质（UV，γ-IR和HU）中暴露：年龄匹配的年轻成人转移到OP50接种板用于γ-IR和UV暴露。将年龄匹配的年轻成年人转移到含HU的接种板中用于HU灵敏度测定（图2A）对于γ-IR和UV处理，蠕虫暴露于DNA损伤来源，然后孵育在20℃下18-20小时。转到步骤C19。
  对于HU治疗，蠕虫是在含有HU的培养基中在20℃温育18-20小时。转到步骤C19。避免厚的细菌草坪，因为它可能会影响UV/IR渗透。只要使用接种过夜生长的细菌的平板。见注释。
  
  图 2.DNA损伤灵敏度测定设计的示意图与固体（A）和液体（B）暴露。 A.对于UVC，γ-IR和HU 处理，将动物暴露于接种的固体NGM培养基上。 B.一套 9个孔用于CPT（绿色）或HN 2（红色）灵敏度。动物是暴露于悬浮在液体培养基中的基因毒素。基因毒素的剂量是由渐变颜色指示。空心圆圈表示空孔。阳性（已知敏感突变体，参见表1）和阴性对照（野生型N2）以及突变体蠕虫在所示的温育柱。短曲线代表图A和B中的动物表示面板A中的细菌草坪
2. 暴露于液体培养基（CPT和HN 2）：将20ml的OP50（OD <600> 2.0）旋转到 LB培养基并除去上清液。加入4毫升M9，涡旋重悬颗粒。例如，将1.3ml细菌溶液分流到3 Eppendorf 管，用于3次剂量的暴露，包括一次用于模拟暴露。
3. 向含有OP50的管中加入基因毒素，高于1.25倍所需的最终浓度和涡旋。例如，for 最后100μM，制备125μM1.3ml HN 2 + OP50
4. 点胶基因毒素：将400μl转移至24孔板的3个孔中的每个孔中（水平方向）。对每个剂量重复此步骤。参见图2B 例如3剂量×3基因型×2基因毒素
5. 分配蠕虫：将年龄相符的年轻成年人转移到15毫升管和用15ml M9 + Triton X-100洗涤两次，然后用两次洗涤只有M9。
  轻轻吸出M9，离开〜300μl溶液底部以避免扰动蠕虫丸。转移100微升蠕虫到每个来自步骤C15的3个垂直孔（100μl×3个孔，参见图2B）。这个将导致总共500μl/孔与期望的最终基因毒素加动物（400 +100μl）的浓度。重复此步骤为每个基因型
6. 用箔包裹板，并在20℃下温和振荡孵育18-20小时。
第6天
1. 重复步骤C2-3两次。
2. 转移蠕虫到种子NGM板。（轻轻旋转板，以扩散任何多余的液体，所以它可以更多有效地被介质吸收。或者，抽吸液体仔细，不吸吮蠕虫。）允许通过孵化恢复在20℃下保持3小时
3. 挑取蠕虫，每板5分，孵化在20℃下〜4小时（5个平板/剂量/基因型）。避免厚的细菌草坪因为它使得计数更难。见注释。
4. P <0> 蠕虫可以移除并丢弃或可用于进一步分析，例如免疫染色或DAPI染色。计数鸡蛋的数量（野生类型N2，预期每板70-100个鸡蛋）。用黑色绘制网格在培养皿盖子的色的标志，您能安置在您的板材下以方便记分。见图3.
  
  图3.原理图表示如何对NGM上铺设和孵化的蛋的数量进行评分琼脂平板上。使用深色标记在培养皿上画一个网格盖。这个盖子可以放在你的板下，以方便刻下立体显微镜
第7天
1. 在20°C孵育20-24小时后，计数未孵化/死亡鸡蛋和孵化的F1蠕虫。对于计数幼虫，它更容易计数当它们变为L2/L3时，未孵化的卵将被降解因此如果你等待的时间更长，更难看到和计数
  如果必要的，在第9天继续计数幼虫和成虫数据如胚胎生存力或幼虫致死率所示图4.
  
  图4. ztf-8突变体的DNA损伤敏感性测定结果。代表性数据使用从Kim和 Colaiacovo（2014）。在用野生型处理后，与野生型相比，ztf-8和em-clk-2突变体的相对胚胎生存力和幼虫致死率指示剂量的γ-1R和HU。结果从两个独立实验（生物学重复）。星号表示通过双尾Mann-Whitney检验计算的统计学显着性，95％置信区间。误差线表示平均值的标准误差。

笔记

代替使用离心机旋转蠕虫，蠕虫也可以通过在工作台上沉降约5分钟来收获。
一般来说，接种超过25只动物，每板5只。每个DNA损伤诱导条件在独立实验中至少复制两次
为了避免厚的细菌菌苔，将50μl过夜生长的OP50（OD 600至2.0）液体培养物种至NGM平板，并用玻璃棒涂布。在37℃孵育12-14小时。

食谱

20％碱性次氯酸盐溶液（45ml）每次清新
24.75ml ddH 2 O
11.25ml 1M NaOH
9.0 ml漂白剂（无杀菌）

致谢

我们感谢Doris Lui，Elisabeth Altendorfer和Jinmin Gao为阅读手稿的证明。这项工作是由国家卫生研究院拨款R01GM072551和R01GM105853支持MPC。这个协议已经从我们以前的工作（Kim和Colaiacovo，2014）改编。

参考文献

Bailly，A.P.，Freeman，A.，Hall，J.，Declais，A.C.，Alpi，A.，Lilley，D.M.，Ahmed，S.and Gartner，A。（2010）。 Gen1/Yen1裂解酶的 Caenorhabditis elegans同系物将DNA损伤信号传导DNA双链断裂修复。 PLoS Genet 6（7）：e1001025。
Brenner，S。（1974）。 Caenorhabditis elegans的遗传学遗传学 77（1）：71-94。
他，F.（2011）。常见的蠕虫介质和缓冲液生物协议 Bio101：e55。
Jaramillo-Lambert，A.，Harigaya，Y.，Vitt，J.，Villeneuve，A。和Engebrecht，J。（2010）。邪恶错误激活了改善配子的检查点质量而不触发雄性生殖细胞中的凋亡。 Curr Biol 20（23）：2078-2089。
Kessler，Z.和Yanowitz，J。（2014）。在C中诱变剂暴露的方法学考虑因素。 elegans 。方法 68（3）：441-449。
Kim，H.M。和Colaiacovo，M.P。（2014）。 ZTF-8与9-1-1复合物相互作用，是DNA损伤反应和双重在C中的断裂修复。 elegans germline。 PLoS Genet 10（10）：e1004723。
Saito，T.T.，Mohideen，F.，Meyer，K.，Harper，J.W.and Colaiacovo，M.P.（2012）。 SLX-1是维持基因组完整性和在秀丽隐杆线虫中促进减数分裂非交换所必需的 germline。 PLoS Genet 8（8）：e1002888。
Ward，J.D.，Barber，L.J.，Petalcorin，M.I.，Yanowitz，J。和Boulton，S.J。（2007）。复制性阻断病变为同源重组提供了独特的底物。 EMBO J 26（14）：3384-3396。