材料和试剂

C。 elegans strain zhIs038 [let-23 :: gfp; unc-119（+）] （Haag ，2014）
注意：有关维持线虫的信息： http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html。
4％琼脂糖垫（示例参见 http://www.wormatlas.org/agarpad.html由Monica Driscoll）
M9溶液与20mM盐酸四甲基噻唑（麻醉）
m9缓冲区（参见配方）

设备

标准显微镜载玻片和18 x 18盖玻片
装有458/488/514nm氩激光的Zeiss LSM710共聚焦显微镜
计算机与FIJI（ImageJ。国家卫生研究所）和适当的插件进行FRAP分析（见下文）

软件

LSM710 ZEN软件（ZEISS）
FIJI（图像J）（国立卫生研究院）

程序

该协议描述了在VPC的基底膜处的LET-23 :: GFP的FRAP，因此"漂白区域"是基底膜的一部分。该方案也可以应用于侧膜和顶膜。

显微镜
1. 使用4％熔化的琼脂糖制备琼脂糖垫。切割焊盘的边缘以获得约1cm×1cm的正方形（图1a）。琼脂糖方形应小于盖玻片的面积（18mm×18mm） mm）。加入3μl的20 mM tetramisol和从晚期L3挑选20-30蠕虫阶段进入tetramisol滴。小心地将盖玻片放在顶部的垫，并用移液管添加M9缓冲液填充空间在琼脂和盖玻片的边界之间。在这些条件动物生存1小时以上，但不分析动物在幻灯片上留下了超过45分钟。
  注意：
  1. 在4细胞阶段（Pn.pxx阶段）不可能鉴定蠕虫，与解剖范围。选择几个蠕虫，确认4细胞阶段在共聚焦显微镜上使用弱荧光来避免漂白。
  2. 在阴道发育的4细胞期的动物在共焦范围内存活更长时间。
  3. 根本的是动物不在幻灯片上移动。弱水平或垂直漂移可以数字校正（见下文），但是在收购期间移动太多的动物不能分析。
2. 在共焦范围：确定腹侧区域外阴细胞位于DIC下的动物（差异干涉对比度）或透射光。使用63x/1.4 NA油透镜并改变为UV荧光以鉴定表达的VPC LET-23 :: GFP。将字段居中在VPC中。
3. 在蔡司LSM710 ZEN软件，使用"通道颜色查找表"进行校正饱和度为每个动物使用"主增益"功能
4. 裁剪/缩放4x并旋转图像以将VPC水平放置视野。重要的是保持4倍放大实验
5. 执行"捕捉映像"（图1b）。
6. 漂白设置：
  1. 在"漂白"窗口中选择488nm氩激光器，激光功率为85％。
  2. 在"扫描后开始漂白"选项选择"2"，并在"迭代"选项中选择"5"次漂白重复。
  3. 在"地区"窗口上，单击区域＃1和区域"获取" 区域＃2的"漂白"。使用"矩形"功能从中选择 "地区"窗口的四个VPC，并将此区域定义为"采集" 和"分析"（图1b）。
  4. 选择基础区域或侧面膜用"矩形"功能进行照片漂白将此区域定义为"漂白"和"分析"（图1b）。
  5. 下这些设置大约70％的信号被光漂白。记录荧光恢复296秒，每8秒一帧（"时间序列"窗口），具有488nm激光激发，功率为20％强度，针孔相当于2.12 Airey单位，帧大小为256 x 256 dpi和3.15微秒的速度（像素驻留）（图1b-c）。
    注意：进行一些漂白实验并分析数据（见下文）以确定在这些条件下是否发生光漂白和恢复。如果照片漂白效率不高，避免增加的百分比激光功率; 而是增加迭代几次以漂白反复。如果恢复没有发生，检查的完整性动物，并减少他们在幻灯片上的时间。
7. 将实验保存为.lsm格式。
数据处理和分析
在FIJI（ImageJ）
1. 安装以下插件：
  StackReg： http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/（Philippe写的 Thévenaz）
  TurboReg： http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/（Philippe写） Thévenaz）
  边缘检测：
  http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id = plugin：filter：edge_detection：start （由Thomas Boudier撰写并由Joris Meys重新打包）
  FRAP规范：
  http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id = plugin：analysis：frap_normalization：start （由Joris Meys写）（Phair等人，2004）
  "StackReg"和"TurboReg"用于对齐图像，因为蠕虫通常在记录期间移动一点。
2. 在FIJI中打开.lsm文件，然后执行以下操作：
  插件> StackReg>变换>刚体>确定
  插件> FRAP分析> FRAP标准
  出现两个窗口："Pre Bleach"和"Post Bleach"窗口（忽略这些窗口）。
  在窗口FRAP分析>设置更改以下内容：前漂白切片：2和后漂白切片：3.时间单位之间载玻片：8（sec）确定。
  注意：在我们的设置中，第一张图片是"快照"。因此，预漂白切片为"2"，后漂白为"3"。
  在Frap分析窗口：> 测量> 自动（图1d）。
3. 选择矩形选择工具。
  1. 转到图像窗口并选择漂白后图像。
  2. 使用矩形选择工具选择FRAP区域。选择一个矩形大小覆盖所有漂白区域（图1e）。使用预漂白和漂白后图片作为参考。
  3. 在FRAP分析窗口> FRAP区域> 设置ROI> 应用于图片> 测量。
    "测量窗口"显示随时间变化的图像的值（该信息将不被使用，但保持打开）使用矩形工具，选择图片的一部分荧光区（图1e'）（背景）并重复该过程 FRAP分析窗口，此时为：Background> 设置ROI> 应用到图像>测量（图1d）。
    使用矩形工具选择4个单元格（图1e''），然后在FRAP分析窗口中单击：
    全细胞>设置ROI>应用于图片>测量（图1d）。
    返回到荧光图像，并使用矩形工具a选择没有被漂白的膜的区域。例如，基础膜与漂白的细胞相邻（图1e"'）。在 FRAP分析窗口重复上述过程，参考> 设置ROI>应用于图片>测量。
  4. 点击"归一化"获得归一化结果。
  5. 此过程用于双重规范化数据：使用参考区（非漂白膜）和总荧光的单个部分中的4个VPC
  6. 将所有结果复制到数据分析软件（例如 Excel），并保留栏"时间"和
  7. "归一化"用于分析。绘制数据：荧光强度（标准化） vs 。时间（秒）（图1f）。
  8. 这些图可用于估计不动和流动分数的分析。流动分数是的分数荧光被恢复并且由差异表示之间的初始和最终荧光。 FRAP漂白分子是不动的，不允许将进入的蛋白质动员到那些中位点，并代表不动的分数。为一个综合解释参见White and Stelzer（1999）。
    
    图1。共聚焦设置漂白和恢复测量和数据分析。。在显微镜载玻片上设置琼脂垫。最佳固定的动物，使用琼脂垫小于盖玻片用3μl四甲氧基苯。 b。 ZEN software的屏幕截图。漂白和恢复设置：红色矩形"1"是采集区域（VPC）。绿色矩形"2"是漂白区（基底膜）。 C。在基底的漂白之前和之后获得的图像膜的VPC超过240秒。 d。 FRAP的参考设置分析插件。 e。选择区域进行归一化处理 FRAP分析插件。 F。 LET-23 :: GFP及其FRAP曲线的实例参数（n = 40只动物）。

笔记

FRAP每个实验约30只动物。在某些情况下，动物在实验过程中移动太多或死亡。一些蠕虫可能无法恢复或停止恢复在第一分钟。在每次测量之前简要确定动物的形态完整性。已经留在垫上太长的动物看起来更少的鼓动，并在头部积累腔状结构。一些蠕虫在塌缩时也可能在z截面中"移动"。做不包括这些数据进行分析。我们最终有大约20只动物，我们用于测量
只有在数据被归一化和绘图之后，才可以估计漂白蛋白的回收率。在进行大型实验之前，进行几次试验光漂白和漂白后采集，以确定设置是否合适，或者在这些条件下动物是否还活着。
不要牺牲分辨率的速度：图像采集的速度对于FRAP分析至关重要。
显微镜透镜：用63x/1.4 NA油透镜漂白和获得在表达LET-23 :: GFP的野生型动物中提供可重复的结果。可能有必要使用40x透镜收集更多的信号用于突变体背景或化学处理，其中LET-23 :: GPF表达可能减少。

食谱

M9缓冲液。 elegans
3.0克KH 2 PO 4 4/
6.0g Na 2 HPO 4
0.5克NaCl
1.0g NH 4 Cl/h 用H sub 2 O将其带到1 L

致谢

资助：这项工作得到瑞士国家科学基金会（no.31003A-146131）给予AHaj和苏黎世Kanton的资助。

参考文献

Haag，A.，Gutierrez，P.，Buhler，A.，Walser，M.，Yang，Q.，Langouet，M.，Kradolfer，D.，Frohli，E.，Herrmann，CJ，Hajnal， -Restrepo，JM（2014）。体内 EGF受体定位屏幕。 elegans 标识Ezrin同源物ERM-1作为信号的时间调节剂。 PLoS Genet 10（5）： e1004341。
Phair，R.D.，Gorski，S.A.和Misteli，T。（2004）。使用光漂白显微镜测量体内动态蛋白与染色质结合的强度。 Method Enzymol 375：393-414。
White，J。和Stelzer，E。（1999）。光漂白GFP显示活细胞内的蛋白质动力学。趋势细胞生物学< em> 9（2）：61-65。