材料和试剂

玉米种子（ Zea mays L.，cv.PR33T56，Pioneer Hi-bred Italia S.p.A.，Parma，Italy）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：60370）
硫酸钙（CaSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：12090）
脲[CO（NH 2）2]（Sigma-Aldrich，目录号：15604）
二乙酰基肟[CH 3 C（= NOH）COCH 3]（Sigma-Aldrich，目录号：31550）
氨基硫脲（NH 2 2 CSNHNH 2）（Sigma-Aldrich，目录号：89050）
硫酸（H 2 SO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：320501）
正磷酸（H 3 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：W290017）
氯化铁六水合物（FeCl 3）（Sigma-Aldrich，目录号：12319）
无菌去离子水
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
CaSO 4（Sigma-Aldrich，目录号：12090）
MgSO 4（Sigma-Aldrich，目录号：746452）
KH sub 2 PO 4（Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
NaFe-EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：03650）
H sub 3 BO 3（Sigma-Aldrich，目录号：B7901）
MnSO 4（Sigma-Aldrich，目录号：221287）
ZnSO 4（Sigma-Aldrich，目录号：Z1001）
CuSO 4（Sigma-Aldrich，目录号：C3036）
Na 2 MoO 4（Sigma-Aldrich，目录号：M1651）
营养液（见配方）
尿素溶液（见配方）
混合颜色试剂（见配方）
混合酸试剂（见配方）
显色试剂（见配方）

设备

生长室和水培生长系统（包括塑料网，塑料盆）
pH计（Jenway，型号：3510）
塑料盒（15 x 10 cm; H 4 cm;图1A，或者您可以使用移液管吸头的底部，Sigma-Aldrich，目录号：P5161）
0.2ml 96孔板（AB ANALITICA Advanced Biomedicine，目录号：B50601;图1B）
澄清96孔平底微孔板（STARLAB，目录号：S1837-9600;图1C）
密封胶带，光学透明（SARSTEDT AG，目录号：95.1994）
热循环仪（Eppendorf，型号：Mastercycler 个人）
轨道振动器（Janke& Kunkel IKA-Labortechnik，型号：KS 501D）
分光光度多孔板读数器（TECAN，型号：GENios Microplate Reader）
计时器
移液管（Eppendorf，型号：0.5-10μl，20-200μl，100-1,000μl，Eppendorf Reference 2）和提示
1.5ml塑料管（Eppendorf，目录号：0030125.150）
吸收纸（Sigma-Aldrich，目录号：Z270849）

图1.塑料设备。 A.塑料盒; B. 0.2ml 96孔板; C.清除96孔微孔板

程序

玉米生长条件
1. 发芽在塑料网的玉米种子被安置在表面的充气的0.5mM CaSO 4溶液在生长室中在25℃在黑暗中。
2. 3天后，将幼苗转移到充气的水培中系统在受控气候条件下含有0.5mM CaSO 4：日/夜光周期，16/8h;光强度，220μmolm -2 s -1 s -1。温度（日/夜）25/20°C;相对湿度70〜80％。
3. 2天后（5日龄）植物在无N的条件下转移4小时营养液含有（μM）：KCl 5; CaSO 4 500; MgSO 4 4 100; KH 2 PO 4 4 175; NaFe-EDTA 20; H sub 3 BO 3 3 2.5; MnSO 4 <0.2; ZnSO 4 <0.2; CuSO 4 <0.05; Na 2 MoO 4 4。 N以1mM CO（NH 2）2（脲处理的植物）的形式提供;要么作为对照，将植物暴露于无N营养液（对照植物）。用水将溶液的pH调节至6.0 氢氧化钾（KOH）。
根部吸收尿素和收集样品
1. 轻轻地删除完好的植物（六个尿素处理的植物和六个控制植物）和水培系统，冲洗植物根在500秒10秒 ml硫酸钙溶液（500μMCaSO 4），重复该步骤两次（图2A）。
2. 在吸收纸上，吸收过量的钙硫酸盐溶液从玉米植物注意不损害根（图2B）。
3. 对于每个测量，填充三个塑料盒将40ml尿素溶液（8ml的1mM尿素溶液储备液和32ml 500μM硫酸钙，最终尿素浓度200μM），并将其放置（速度90rpm）。
4. 将计时器设置为向上计数10分钟。
5. 在每个塑料盒中，放置两个完整的植物淹没根尿素溶液（避免浸没植物的种子）。开始定时器（T = 0min），在96孔中收集60μl尿素溶液板（图2C-E）
6. 净摄取量测量为尿素消耗从溶液每单位时间，移除溶液样品（60μl）用于尿素测定每2分钟10分钟，跨度时间期间摄取具有线性趋势。因此，继续收集尿素溶液从每个塑料盒每两分钟从起点，在T = 2， 4，6，8和10分钟。
7. 在收获时间结束时，关闭轨道振动器。在每个塑料盒中，切根和干根吸收纸; 然后称重两株植物的玉米根（图2F）
  
  图 2.收集样品的程序。 A.冲洗玉米根; B.干燥玉米根在吸收纸上; C.在轨道摇床上准备植物; D.两个玉米植物在每个具有根的塑料盒中转移浸没在尿素溶液中; E.在实验时间跨度 10 min，每两分钟收集60μl尿素溶液; F.结束的实验，切割和重量的根。

尿素标准

在1.5ml塑料管中，稀释1mM尿素溶液原液，如表1所示，以产生标准曲线
表1.尿素标准

尿素溶液储液（1 mM）	硫酸钙（500μM）	最终尿素浓度
0微升	1000微升	0μM
100微升	900μl	100μM
120微升	880μl	120μM
140微升	860微升	140μM
160微升	840微升	160μM
180微升	820微升	180μM
200μl	800μl	200μM
250微升	750微升	250μM

将60μl的标准品转移到96孔板的单独的孔中。

通过测定比色反应测定尿素
1. 通过混合25ml混合酸试剂和25ml混合颜色试剂制备新鲜的显色试剂
2. 向含有样品或标准品的96孔板的每个孔中加入120μl显色试剂
3. 用密封带密封板。
4. 在热循环仪中在99℃下孵育15分钟（盖温度：105℃）
5. 在冰上冷却样品5分钟。
6. 从板上取下密封胶带，将160μl的所有样品转移到一个带有平底的透明96孔微孔板中。
  注意：为了避免材料损失，在从板上取下密封胶带前，用针头对孔进行减压。
7. 使用微量滴定板读数器测量540nm处的吸光度（图3）
  
  图3.来自微量滴定板读数器的输出数据的示例 540 nm。蓝色和红色是突出显示的标准品和样品，分别
8. 玉米根吸收尿素的能力测定尿素从溶液中的消耗时间跨度为10分钟。尿素的净吸收率表示为μmol 尿素/g根鲜重（FW）/h。提供了计算的示例在补充文件1 中。

笔记

收获后，可以在-20℃下冷冻样品，并在第二天进行样品。
通过由Killingsbaeck（1975）和Mérigout等人（2008）修改的二乙酰基肟和氨基硫脲比色测定法测定尿素。为了分析大量样品，使用96孔微量培养板进行比色反应，并优化试剂的体积。 Kojima等人（2007）使用相同的比色反应来确定拟南芥组织中的尿素累积。作者指出，脲脲尿囊素，鸟氨酸，精氨酸和尿酸，不干扰尿素测定，虽然没有测试其他脲类。

食谱

营养液
KCl 5μM
CaSO 4 <500μM
MgSO 44μM100μM KH <2> PO 175微米。
NaFe-EDTA20μM
H <3> BO <3> 2.5μM
MnSO 4 <0.2μM ZnSO 4 <0.2μM CuSO 40.05μM Na MoO 40.05μM
尿素溶液仓
1 mM尿素
500μM硫酸钙
混合试剂
7％（v/v）0.2M二乙酰基单肟
7％（v/v）0.05M硫代氨基脲
混合酸试剂
20％（v/v）硫酸 9％（v/v）原磷酸 0.06％（v/v）74mM氯化铁六水合物
显色试剂
50％（v/v）混色试剂
50％（v/v）混合酸试剂

致谢

根吸收测量的程序改变自先前关于硝酸盐吸收的研究（Rizzardo等人，2012）。这项工作得到意大利自治区Friuli Venezia Giulia和意大利大学和研究部的资助。

参考文献

Kojima，S.，Bohner，A.，Gassert，B.，Yuan，L。和von Wiren，N。（2007）。 AtDUR3代表高亲和力尿素转运穿过氮缺乏质膜的主要转运蛋白> Arabidopsis 根。植物J 52（1）：30-40。
Merigout，P.，Lelandais，M.，Bitton，F.，Renou，J.P.，Briand，X.，Meyer，C.and Daniel-Vedele，F。（2008）。拟南芥植物中尿素摄取和同化的生理和转录组学方面。/a> Plant Physiol 147（3）：1225-1238。
Rizzardo，C.，Tomasi，N.，Monte，R.，Varanini，Z.，Nocito，F.F.，Cesco，S.and Pinton，R。（2012）。镉抑制玉米中高亲和力硝酸盐摄入的诱导（ Zea mays L.）根。植物 236（6）：1701-1712。
Wang，WH，Kohler，B.，Cao，FQ，Liu，GW，Gong，YY，Sheng，S.，Song，QC，Cheng，XY，Garnett，T.，Okamoto，M.，Qin， -Roeber，B.，Tester，M.and Liu，LH（2012）。 Rice DUR3介导高亲和力尿素转运，并在改善尿素采集和利用方面发挥有效作用在拟南芥中表达。新植物 193（2）：432-444。
Zanin，L.，Tomasi，N.，Wirdnam，C.，Meier，S.，Komarova，N.Y.，Mimmo，T.，Cesco，S.，Rentsch，D.and Pinton，来自玉米根的高亲和力尿素转运蛋白的分离和功能表征。 BMC Plant Biol 14：222.
Zanin，L.，Zamboni，A.，Monte，R.，Tomasi，N.，Varanini，Z.，Cesco，S.and Pinton，R。（2015）。转录组分析强调了玉米根氮获得尿素和硝酸盐的相互作用。 em> Plant Cell Physiol 56（3）：532-548。