材料和试剂

木质纤维素生物质
注：根据研究者的目的，可以使用来自不同物种，器官或组织的木质纤维素生物质，只要其如以下程序部分所示方便地制备即可。有关此协议的应用示例，请参阅da Costa等。（2014）。
去离子的H 2 O 2 /
70％（v/v）含水乙醇（分子生物学级）
氯仿/甲醇（1:1 v/v）（分子生物学级）
100％丙酮（分子生物学级）
I型猪α-淀粉酶（Sigma-Aldrich，目录号：A6255）（盐悬浮液; 29mg蛋白质/ml; 1714单位/mg蛋白质）
0.1 M乙酸钠缓冲液（见配方）
0.1 M甲酸铵缓冲液（见配方）
0.001 M叠氮化钠（参见配方）

设备

实验室安全设备（特别是在叠氮化钠处理期间，建议戴手套，护目镜和安全面罩）
冰柜
pH计
冷冻干燥机（Edwards Pirani 501 Super Modulyo，Edwards Ltd.）
分析磨（Ika，A11基本）
筛（孔径：0.18和0.85mm）
塑料离心管（50ml，带螺旋盖）（Greiner Bio-One GmbH）
涡流搅拌器
摇动培养箱
离心机
通风橱
阻止加热器
装备有Golden Gate ATR附件（Specac）的FTIR光谱仪（Equinox 55，Bruker Optik）

软件

Bruker OPUS IR光谱软件（版本5.0; Bruker Optik）

程序

生物质制备 - 有机溶剂洗涤
1. 预冷冻和冷冻干燥木质纤维素生物质（时间可变化取决于样品来源（对于整个芒草 spp 将样品冷冻干燥超过7天以确保完成干燥）。
2. 研磨组织至粒度在0.18-0.85范围内 mm（建议设备：IKA A11手持分析磨;筛筛目尺寸为80和20μm）。
3. 称取约1g地面植物生物质放入50ml塑料离心管中
4. 加入30ml 70％（v/v）乙醇水溶液，使用涡旋充分混合混合器中，并置于设定在40℃/150rpm的摇动培养箱中12小时
5. 在900×g离心10分钟，通过倾析或吸出弃去上清液。
6. 加入30ml 70％（v/v）乙醇水溶液，使用涡旋混合器混合这一次在40℃/150rpm下孵育样品30分钟
7. 在900×g离心10分钟并弃去上清液
8. 重复步骤A6-7。
9. 加入20ml氯仿/甲醇（1:1 v/v）溶液，混合重悬浮沉淀并在25℃下在振荡培养箱中放置30分钟 ℃和150rpm
10. 在900×g离心10分钟，并在氯仿/甲醇洗涤后弃去上清液。
11. 重复步骤A9-10两次。
12. 加入15ml丙酮，混合以重悬浮沉淀，并在25℃和150rpm下在振荡培养箱中放置30分钟。
13. 在900×g离心10分钟，并在丙酮洗涤后弃去上清液。
14. 重复步骤A12-13两次。
15. 使有机洗涤的生物质样品在通风橱中干燥过夜（或者它们可以放置在设定在35℃的烘箱中约16小时）。
生物质制剂 - 淀粉去除
1. 将干燥的，有机溶剂萃取的生物质再悬浮于15ml的0.1M乙酸钠缓冲液（pH5.0）中
2. 在加热块中在80℃下加热20分钟以诱导淀粉糊化
3. 在冰上冷却悬浮液15分钟。
4. 在900×g离心10分钟并弃去上清液
5. 用30ml H 2 O 2洗涤沉淀两次，离心（900×g 10分钟），每次洗涤后除去上清液。
6. 向沉淀中加入以下试剂：10ml 0.1M铵甲酸缓冲液（pH6.0），10μlI型猪α-淀粉酶（47单位/ 100mg细胞壁）和500μl0.001M叠氮化钠溶液
7. 在25℃/110rpm下，在振荡孵育器中保持48小时
8. 加热至95℃/15分钟终止消化。
9. 在冰上冷却样品15分钟
10. 在900×g离心10分钟并弃去上清液
11. 用30ml H 2 O洗涤沉淀三次，用20ml洗涤两次丙酮，离心（900×g，10分钟）和上清液每次洗涤后除去
12. 让制备的细胞壁材料样品在通风橱中干燥过夜（或者可以留在其中设定在35℃的烘箱约16小时; 样品稳定个月，如果保存在密封容器中并保护从直接光）。
生物质检验 - 傅里叶变换中红外光谱仪
1. 无需进一步制备，将约10mg的干细胞壁粉末置于金门ATR晶体上
2. 使用金门ATR附件的砧座将样品与ATR晶体最佳接触。
3. 对于每个生物质样品，重复收集光谱
  注意：每个光谱由ATR在中红外范围内收集 4,000-600 cm ^-1 4 cm ^-1 。用背景吸光度校正光谱减去空ATR晶体的光谱。
4. 使用刮刀或刀片回收样品（视频1）。
5. 用样品之间的实验室组织擦拭物和乙醇清洁接触区域
6. 对所有样品重复步骤C1-5。
7. 将每个收集的光谱转换为单个文本文件包含光谱二维笛卡尔坐标（ x ， y ）（图1）在两个单独的列（我们使用Bruker OPUS IR 光谱软件）。随后，包含原始数据的矩阵并且可以创建光谱之间的潜在关系使用数值或统计计算软件（如作为R或MATLAB）。例如，我们使用PCA来识别特征最不同的是从芒草（Miscanthus）中收集的光谱。叶和茎细胞壁生物量（图2）
  
  视频1.来自细胞壁生物质的FTIR光谱的收集
  
  图1.细胞壁生物量（芒草 spp。）的FTIR光谱，使用Opus IR光谱软件（A），并转换成文本文件包含它们在两个独立的笛卡尔坐标栏（B）
  
  图2.主成分1（PC1）和 Miscanthus spp的主成分二（PC2）得分。叶和茎 FTIR产生的细胞壁光谱（da Costa等人，2014）

食谱

0.1M乙酸钠缓冲液（pH5.0）通过将11.55ml冰醋酸在500ml H 2 O中混合并用H 2 O调节至1L来制备0.2M乙酸（A）通过将27.21g乙酸钠三水合物溶解在800ml H 2 O中并通过H 2 O调节至1L来制备0.2M乙酸钠溶液（B）将14.8ml的A，35.2ml的B和50ml的H 2 O混合用pH计确认pH = 5.0（如果需要，可以用10M乙酸钠或冰醋酸调节pH）
0.1M甲酸铵缓冲液（pH 6.0）将6,306mg甲酸铵溶解在500ml H 2 O中并用甲酸调节pH至6.0 用H sub 2 O补充到1 L
用pH计确认pH = 6.0（如果需要，可以用甲酸调节pH）
0.001 M叠氮化钠将10mg叠氮化钠溶于145ml H 2 O中

致谢

这里描述的方法在da Costa等人（2014）中用于芒草属（Miscanthus）的分析。细胞壁样品。该程序的一部分改性自各种来源：Foster等人（2010）的有机溶剂洗涤和淀粉胶凝化;从Persson等人（2007）和Kong等人（2011）的淀粉去除;和来自Allison等人的傅立叶变换中红外光谱（Eur.J.Med。）（2009）。最初的工作得到欧洲区域发展基金的支持，通过威尔士政府为BEACON拨款号8056授予R. M. F. da Costa，G. G. Allison和M. Bosch。

参考文献

Allison，GG，Thain，SC，Morris，P.，Morris，C.，Hawkins，S.，Hauck，B.，Barraclough，T.，Yates，N.，Shield，I.，Bridgwater，AVand Donnison，（2009）。通过傅里叶变换红外光谱和偏最小二乘法对常年饲料和能源草中羟基肉桂酸和木质素的定量平方回归。 Bioresour Technol 100（3）：1252-1261。
Carpita，N. C.和McCann，M.C。（2015）。表征可见和不可见的细胞壁突变体表型。/em>（打印前的电子版）
da Costa，R.M.，Lee，S.J.，Allison，G.G.，Hazen，S.P.，Winters，A.and Bosch，M。（2014）。木质纤维能源作物中细胞壁特性的基因型，发育和组织衍生变异Miscanthus 。 Ann Bot 114（6）：1265-1277。
Foster，C.E.，Martin，T.M.and Pauly，M。（2010）。植物细胞壁（木质纤维素生物质）的综合组成分析第一部分：木质素。（37）：e1745。
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Kong，Y.，Zhou，G.，Yin，Y.，Xu，Y.，Pattathil，S.and Hahn，M.G。与半乳糖醛酸转移酶相关的拟南芥基因家族的分子分析。 Plant Physiol 155（4）：1791-1805。
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Persson，S.，Caffall，K.H.，Freshour，G.，Hilley，M.T.，Bauer，S.，Poindexter，P.，Hahn，M.G.，Mohnen，D.and Somerville，C。（2007）。拟南芥不规则xylem8突变体缺乏葡糖醛酸木聚糖和homogalacturonan，对于二次细胞壁完整性至关重要。植物细胞 19（1）：237-255
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