材料和试剂

患者或捐赠者的全血
细胞因子等分试样（IFNα，IL-6，IL-7，IL-10，IL-21，LPS，PMA/Ionomycin等）
1. IFNa（PBL干扰素来源，目录号：11105-1）
2. IFNg2（BD Biosciences，目录号：554617）
3. IL6（BD Biosciences，目录号：550071）
4. IL7（BD Biosciences，目录号：554608）
5. IL10（BD Biosciences，目录号：554611）
6. IL21（Life Technologies，Gibco ，目录号：PHC0214）
7. IL2（BD Biosciences，目录号：554603）
8. CD3（BD Biosciences，目录号：555329）
9. CD28（BD Biosciences，目录号：555725）
10. LPS（Sigma-Aldrich，目录号：L7770）
11. IL5（Pepro Tech，目录号：200-05）
12. IL17A（Pepro Tech，目录号：200-17）
13. IL17E（Pepro Tech，目录号：200-24）
甲醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：A452SK-1）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（Ca 2+，Mg 2+，Mg 2+）</sup>
用0.1μm旋转过滤器过滤表型和磷蛋白抗体，以获得标记物的均匀染色
来自Fluidigm Sciences的Ir-嵌入剂储备溶液（可以使用Rh103-嵌入剂）
10x磷酸盐缓冲盐水（Rockland，目录号：MB-008）
智能管1x解冻缓冲液（Smart Tube Inc.）
完成RPMI（参见配方）
CyFACS缓冲区（参见配方）

设备

Nunc Coded Cryobank Vials（Cluster tubes，目录号：374078）
37°C水浴
生物安全柜
离心机
CO 2培养箱中37℃培养
校准移液器
8或12针吸气器（V& P Scientific，型号：Inc VP187A）
智能管蛋白质稳定剂（Smart Tube Inc.）

程序

准备簇管中的刺激
1. 准备细胞因子在5x浓度在完全RPMI，足够体积吸取50μl到每个样品和对照的孔中。看到下图为全板稀释的图表
2. 具有等分的兴奋剂的簇管可以在-80℃下冷冻，直到进一步使用
满板示例
细胞因子刺激的实例
IFNα：使用的刺激的最终浓度= 10,000单位/ml
IFNγ2：使用的刺激的最终浓度= 50ng/ml
IL6：使用的刺激的最终浓度= 50ng/ml
IL7：使用的刺激的最终浓度= 50ng/ml
IL10：所用刺激的最终浓度= 50ng/ml
IL21：使用的刺激的最终浓度= 50ng/ml
IL2：使用的刺激的最终浓度= 50ng/ml
CD3 =2.5μl，在990μl（终浓度500ng/ml）中 CD28 =10μl在上述培养基（终浓度2,000ng/ml）中 LPS：使用的刺激的最终浓度=1μg/ml
PMA：10ng/ml终浓度/ml
离子霉素：1,000ng/ml终浓度/ml
IL5：使用的刺激的最终浓度= 10ng/ml
IL17A：使用的刺激的最终浓度= 50ng/ml
IL17E：使用的刺激的最终浓度= 50ng/ml
刺激
1. 将从供体收集的血液在37℃下在CO 2培养箱中在培养箱中休息1小时。在使用前，取出所需的数量簇管用来自-80℃冰箱的兴奋剂并让其温热 37℃水浴5-10分钟。
2. 等分200μl全血使用多通道移液管进入簇管板的柱1。更改每个病人之间的提示。
3. 根据捐赠者的数量重复所有的管柱。
4. 工作尽可能快。
5. 敲击板混合，并在37℃下在CO 2孵育器中孵育15分钟。
6. 从培养箱中取出受刺激的全血15分钟，并使用多通道移液器，每个添加250微升1蛋白质组稳定剂列的患者样品在群集管块。移液器上下移动以针对每个患者进行混合。更改患者之间的提示。加上稳定剂以你添加全血的顺序刺激
7. 在室温下孵育10分钟。在这点，其可以在-80℃冷冻，直到其准备解冻并表面染色
  
  图1。我们的程序中所述步骤的流程图
表面染色
1. 取出所需数量的冷冻刺激簇管全血可以舒适地运行在CyTOF在1天。（您可以通过CyTOF在一天内运行3-4簇样品或条带。一个集群或条有8口井）。在冷水中解冻约15分钟。
2. 使用a 移液管，将固定的全血样品（450μl）转移到标记的深孔板用1.2ml的1x Thaw-Lyse，并让它坐10分钟室温。
3. 在548rcf（×g/g）离心细胞10分钟，在室温。
4. 吸出细胞的上清液。
5. 涡旋球团，并加入1.6毫升，1解冻溶胞，让它坐在室温下5-10分钟。离心细胞在548 rcf（ x g ）10 min。
6. 吸出细胞的上清液。
7. 涡旋并用约1.8ml CyFACS洗涤沉淀
8. 在4℃下以974rcf（×g/g）离心细胞10分钟。
9. 吸出来自细胞的上清液，使得约50ul保留在每个孔的底部。
10. 在磷酸盐缓冲盐水的金属螯合制备鸡尾酒聚合物标记的表面抗体滴定。使每个孔有足够的体积有20微升鸡尾酒。吸入0.1微米旋转过滤器和离心机在桌面微量离心机（RCF = 14,000）在室温下2分钟。这确保甚至染色。
11. 加入20微升的抗体鸡尾酒的细胞深孔板，涡旋混合并让其在室温下孵育温度30分钟。
12. 用1.8ml磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，并在4℃下以974rcf（×g/g）离心细胞10分钟。吸气。
13. 通过向每个孔中加入600μl冷甲醇来透化细胞的深井块使用多通道移液器。移液器上下移动以针对每个患者进行混合。更改患者之间的提示。储存细胞在该点过夜，在-80℃。这是为了方便工作流。
14. 从冷冻机中取出样品。加入1.0ml CyFACS。在4℃下以974rcf（×g/g）离心细胞10分钟。吸出这样约100μl保留在孔中。
15. 以1.8ml /孔的CyFACS缓冲液洗涤
16. 在4℃下以974rcf（×g/g）离心细胞10分钟。通过抽吸弃去上清液。
细胞内染色
1. 在PBS的金属螯合聚合物标记细胞内的鸡尾酒抗体。充足每个样品的体积具有20μl的混合物。移入0.1μm 旋转过滤和离心机在台式微量离心机（RCF = 14000）2 min。
2. 加入20μl的抗体鸡尾酒细胞在深孔板中，涡旋混合并让其在室温下孵育温度30分钟
3. 加入1.6ml PBS。在4℃下以974rcf（×g/g）离心细胞10分钟。抽吸弃去上清液。
4. 在Ir-嵌入剂的PBS中进行1：200稀释。加入20μl稀释 Ir-嵌入剂溶液加到每个样品中，用移液管混合。在冰上孵化 20分钟。
5. 在MilliQ水中洗涤3次。在4℃下以974rcf（×g/g）离心细胞10分钟。抽吸弃去上清液。
6. 将样品置于1ml MilliQ水中，过滤样品通过细胞过滤器。标准后获得Cytof样品仪器设置程序。

代表数据

表1. 磷酸化-CyTOF平板中的抗体

全血门控方案

图2.全血门控方案

笔记

染色体积保持在总共50至60μl。
洗涤步骤是最小化背景的关键。吸出使每次洗涤后仅剩约〜100μl体积。在下一次洗涤之前涡旋
通过上下移液彻底重悬，有助于均匀染色
样品稀释对于收集最佳数量的单细胞事件至关重要; 目标为约300次事件/秒。
不要将样品缓冲液或洗涤缓冲液暴露在空气中，因为灰尘积累会导致堵塞
每个样品应该重新悬浮在水中，并在运行之前通过尼龙网过滤; 不要让样品坐在水面上，因为细胞会溶解和结块，导致堵塞和事件的丢失。

食谱

完全RPMI（Hyclone RPMI-1640 Medium）
含10％FBS的RPMI
青霉素/链霉素
谷氨酰胺
CyFACS缓冲区
1x含有0.1％BSA的CyPBS PBS和0.05％叠氮化钠在MilliQ水中制造
注意：不要使用FBS！

致谢

这项工作得到来自美国国立卫生研究院的拨款S10RR027582,5U19AI057229和5U19AI090019的支持。

参考文献

Bendall，SC，Simonds，EF，Qiu，P.，Amir el，AD，Krutzik，PO，Finck，R.，Bruggner，RV，Melamed，R.，Trejo，A.，Ornatsky，OI，Balderas，RS，Plevritis ，SK，Sachs，K.，Pe'er，D.，Tanner，SD和Nolan，GP（2011）。跨越人类造血连续区的不同免疫和药物反应的单细胞质谱仪。 332（6030）：687-696。