材料和试剂

根据Boavida和McCormick（2007）的拟南芥 day-0花
用于分析的无水乙醇（EtOH）（Merck Millipore，目录号：107017）
三氟乙酸12.93N（TFA）（Sigma-Aldrich，目录号：T62200）
肌醇2mM（Sigma-Aldrich，目录号：I5125）。
甲醇-HCl 3N（Sigma-Aldrich，目录号：33051 Supelco）
甲醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：10010280）
甲硅烷化试剂（HMDS：TMCS：吡啶，3:1:9 Sylon TM HTP）（Sigma-Aldrich，目录号：33038 Supelco）
环己烷（Acros Organics，目录号：279590010）
单糖标准
阿拉伯糖（Sigma-Aldrich，目录号：A3256）岩藻糖（Sigma-Aldrich，目录号：F8150）半乳糖（Sigma-Aldrich，目录号：G0750）半乳糖醛酸（Sigma-Aldrich，目录号：857289）葡萄糖（Merck Millipore，目录号：8337.0250）
葡萄糖醛酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8645）甘露糖（Sigma-Aldrich，目录号：M4625）鼠李糖（Sigma-Aldrich，目录号：R3875）木糖（Sigma-Aldrich，目录号：X2126）
拟南芥花粉萌发培养基（参见食谱）
三氟乙酸（2N）（参见配方）

设备

倒置显微镜Olympus CK2
离心机Allegra® X-15R Beckmann Coulter
热水浴（70℃和90℃）
40-ml玻璃波特均化器
冷冻干燥机
培养箱（22℃，80℃和110℃）
气流下的样品浓缩器（Techne，目录号：FSC400D）
GC-EI-MS仪器由用于色谱分离的Zebron Z5-MSi（30μm，0.25mm内径，0.25μm膜厚度，Phenomenex）毛细管柱，Hewlett-Packard 6890系列气相色谱仪与Autospec质谱仪 EBE几何（Micromass，Manchester，UK），装备有Opus 3.1数据系统
1.5 ml Eppendorf管
涡流
双镊子
50毫升Falcon
微量注射器（10μl，Hamilton）

程序

体外拟南芥花粉管生长和固定
下面描述的协议类似于Wang和Jiang（2014）提供的协议，有几个区别。
1. 根据Boavida和McCormick（2007）描述的方法，在体外拟南芥花粉。
  1. 收获40新鲜开放的拟南芥拟南芥花（早上是最好的）。
  2. 浸没在1ml花粉萌发培养基在1.5ml Eppendorf管中。
  3. 剧烈手动摇动管，并使用涡旋5分钟从花药释放花粉粒。
  4. 用倒置显微镜检查花粉密度。
  5. 用一对镊子去除所有的花碎屑。
  6. 将花粉悬浮液在3,200×g下旋转7分钟（微黄色颗粒应该是可见的）。
  7. 除去上清液。
  8. 加入250微升花粉萌发培养基，并重悬沉淀
  9. 将管水平放置在孵化器中在22°C在黑暗中6小时。
  10. 6小时后，用倒置显微镜检查花粉萌发和花粉管生长（图1）。
2. 通过加入750微升无水乙醇固定花粉培养（最终浓度75％EtOH）并保持在4℃（不超过一个月）。
  注意：需要约90个花粉培养物（3,600朵花）检测次要糖如Kdo （2-酮基-3-脱氧-D-甘露 - 辛糖酸），其中一种成分鼠李半乳糖醛酸聚糖-II（RG-II）。对于其他主要细胞壁组件，花粉管从400朵花一般就足够了。
  
  图1. 6 h-old拟南芥花粉管。请注意，花粉粒密度对于获得良好的发芽率很重要。
果胶提取和分析
1. 热水果胶提取：
  1. 池中所有的花粉文化 50-ml Falcon管中并在4,700×g离心5分钟。重复离心步骤，如果花粉培养物的总体积超过 45 ml。
  2. 弃去上清液并用15mL EtOH 70％洗涤以从萌发培养基中除去盐和蔗糖。
  3. 在70℃的热水浴中孵育15分钟
  4. 使用40ml玻璃波特均化器手动研磨材料，直到没有可见的碎屑
  5. 以4,700×g离心5分钟，弃去上清液
  6. 让沉淀干燥，直到没有上清液可见（使用干燥空气流可能需要不超过2小时）。
  7. 将沉淀重悬于5ml蒸馏水中。
  8. 在90℃的热水浴中孵育1小时。
  9. 以4,700×g离心5分钟。
  10. 冷冻干燥上清液。没有液体必须可见（可能需要一天）。
2. 气相色谱分析的样品制备：
  注意：玻璃器皿管优先用于样品制备。含有最常见细胞壁的标准样品单糖（Ara，Fuc，Gal，GalUA，Glc，GlcUA，Man，Rha，Xyl）是在没有TFA水解步骤的同时制备。
  1. 在110℃下用250μlTFA 2 N水解提取物2小时。
  2. 在样品中加入50μl的myo - 肌醇2mM。 Myo - 肌醇被用作内标。
  3. 使用250μl干燥的1M在80℃进行甲醇分解16小时甲醇-HCl（用甲醇稀释3M原液）。
  4. 使用500μl甲醇洗涤样品两次。
  5. 将甲基糖苷转化成它们的三甲基甲硅烷基衍生物在110℃下用200μl甲硅烷化试剂（HMDS：TMCS：吡啶，3:1:9，Supelco）
  6. 使用500μl环己烷洗涤样品两次。
    注意：使用带有样品的干燥空气流对样品进行空气干燥浓缩器在每个步骤之间（也可以使用氮气流）。加入1ml环己烷，涡旋管。
3. 单糖分析：
  1. 在GC-EI-MS仪器中注入0.5μl样品，使用10 μl注射器，在不分流模式。氦是载气和流速为0.8ml/min。
  2. 在开始温度编程 120℃2分钟，以10℃/min升温至160℃，然后在1.5℃升温至220℃ ℃，最后以15℃/min升温至280℃（在270℃保持1小时） min）。喷射器，接口和管线的温度 250℃。使用70eV的电子能量记录EI质谱，加速电压为8kV，分辨率为1000。陷阱电流为200μA，磁体扫描速率在m/z范围600-38上为1s/decade。离子源的温度为250℃
  3. 数据使用软件STAR Workstation Varian 5.52进行处理。首先所有，重要的是检查峰和峰面积（A）是否分配通过与之前的标准样品比较，对每个光谱正确进行。每种单糖的响应因子（R sub）通过对每个标准的仪器校准来确定糖。峰面积积分在每种糖的总色谱图上和内标（肌醇）。每种糖的量是由公式计算：
  图2给出了完整协议的概述
  
  图2.糖协议的示意图来自拟南芥花粉的热水提取物的组成管
  1. 拟南芥花粉萌发培养基
    5mM CaCl 2
    0.01％H 3 BO 3 sub。 1mM MgSO 4 5 mM KCl
    10％（w/v）蔗糖 pH 7.5
  2. 三氟乙酸（2N）
    0.15体积的三氟乙酸12.93N
    0.85体积的新鲜蒸馏水
    注意：使用玻璃器皿。

致谢

该协议最初在Dumont等人（2014）中描述。这项工作得到了鲁昂大学，上海法国大学的支持，以及由INTERREG IVA项目选定的"Trans Channel Wallnet"项目。法国（海峡） - 英国欧洲跨境合作项目，由ERDF资助。作者还感谢Labex SynOrg（ANR-11-LABX-0029，CRUNCH网络和欧洲区域发展基金（ERDF 31708）。

参考文献

Boavida，L.C。和McCormick，S。（2007）。技术进步：温度作为增加和可再现性的决定因素< （3）：570-582。 in vitro pollen germination in Arabidopsis thaliana
Dumont，M.，Lehner，A.，Bouton，S.，Kiefer-Meyer，M.C.，Voxeur，A.，Pelloux，J.，Lerouge，P.and Mollet，J.C。细胞壁果胶聚合物rhamnogalacturonan-II是正常花粉管延长所必需的：推定的唾液酸转移酶like protein。 Ann Bot 114（6）：1177-1188。
Wang，H.和Jiang，L。（2014）。花粉管的免疫荧光标记生物协议 4（10）： e1131。