种子发芽和植物生长
1. 将大麦种子放在含有2片滤纸（90mm直径）和6ml无菌水的9cm直径培养皿中。
2. 用铝箔覆盖培养皿，在4℃下在黑暗中分层2天
3. 转移板21°C在黑暗中2天，以发芽种子
4. 将移植化的幼苗移植到含有John Innes堆肥No 2的3英寸盆中，密度为2个幼苗/盆。
5. 在长日照条件下（16小时/8小时）在22℃下生长植物，底部浇水每隔一天。相对湿度保持在 70％。

病毒诱导的基因沉默
注意：BSMV是具有称为α，β和γRNA的三种基因组组分的单链RNA病毒。代表待沉默的基因片段的转录序列直接插入在DNA质粒内编码的γ开放阅读框的终止密码子的下游。 RNA由在DNA质粒内编码的α，β和γ合成。大麦幼苗被所有三个RNA片段感染，导致病毒dsRNA的合成，其激活抗病毒RNA沉默途径，导致目标大麦基因沉默。在这里我们显示大麦油菜甾体 - 不敏感-1（BRI1）基因的VIGS使用两个构造目标非重叠基因片段。包含保护叶绿素免受光漂白的大麦八氢番茄红素去饱和酶（PDS）基因的185bp片段的BSMVγRNA构建体用作VIGS实验的阳性对照。

从基因组DNA扩增BRI1 基因的两个独立片段的大麦cv。 Akashinriki使用片段特异性引物 HvBri1A-F/R或HvBri1B-F/R（表1）。在10μl体积中进行PCR 包含1μl10X高保真PCR缓冲液，0.4μl50mM MgSO 4，0.2 μl10mM dNTP Mix，0.2μl每种5μM正向和反向引物，0.05 μl5U /μl铂/Taq DNA聚合酶，30ng基因组DNA和无菌 Milli-Q H 2 O至10μl。 PCR反应在Peltier热进行循环DNA发动机和PCR程序组成的初始变性步骤在94℃2分钟，30个循环的变性94℃ 30秒，60℃退火30秒，68℃延伸45秒和在72℃下5分钟的最终延伸步骤

表1.用于BRI1 基因的VIGS的引物

VIGS引物名称	正向引物（5- 3）	反向引物（5-3）
HvBRI1：A	CGATTAATTAAGCGGAGGCAGAAGAATGA	CGACCCGGGGTCACCCTGGCCACTCAC
HvBRI1：B	CGATTAATTAAGTGAGTGGCCAGGGTGAC	CGACCCGGGTGGATGATGTGCGGAATG
HvBRi1：RT	CAACGATGCTCAAGGTGATG	CCGGTGGTCATCTTCCTAAT
HvRNAH	GCACAGGGAATCGTCAAAGT	TCAAAACAACACAACATCGAAGT
pGamma	TGATGATTCTTCTTCCGTTGC	TGGTTTCCAATTCAGGCATCG

使用Primer3软件（版本0.4.0; http://frodo.wi.mit.edu）设计引物/primer3/）。
*注意：当设计用于基因沉默的引物时，确保 PCR产物将不含有所用酶的限制性位点以在稍后阶段线性化质粒。

扩增的基因使用pGEM-T Easy将片段克隆到pGEM-T载体中克隆试剂盒并转化到E中。 Coli DH5α。
携带沉默片段的重组pGEM-T载体然后用PacI和SmaI消化。通过凝胶纯化插入物提取，然后克隆到PacI和SmaI消化的γRNA载体中 pSL038-1。
所得的重组pSL038-1-BRI1A（pγ-BRI1A）和携带BRI1 基因片段的pSL038-1-BRI1B（pγ-BRI1B）质粒转化到E。大肠杆菌DH5α通过电穿孔并克隆随后使用Macrogen Inc.（Korea）对产物进行测序载体特异性引物pGamma-F/R（表1）检查方向沉默片段。具有正确方向的阳性克隆储存在-80℃下作为甘油储备液。
E。大肠杆菌甘油原液携带质粒pα，pβ，pγ，pγ-PDS，pγ-BRI1A和pγ-BRI1B进行条纹在补充有100mg/L氨苄青霉素和培养物的LB-琼脂平板上在37℃生长过夜
从每个平板的单个菌落接种到补充有100mg/L氨苄青霉素的10ml LB肉汤中培养物在37℃下生长过夜。
质粒提取使用QIAGEN QIAprep离心机小量制备试剂盒进行产物方案，但不包括RNaseA从缓冲液P1（任何残留在质粒DNA制备中携带的RNA酶A将干扰后期阶段的体外转录。）
质粒pα，pγ， pγ-PDS，pγ-BRI1A和pγ-BRI1B用MluI和质粒线性化 pβ用SpeI线性化。线性化质粒沉淀使用1/2体积的5M乙酸铵和2体积绝对乙醇，随后在18,000×g离心15分钟。 DNA沉淀用70％乙醇洗涤，风干并重悬于50μl 无RNase水。（对于50个幼苗，每个的1μg线性化质粒）。
加盖的体外转录物从线性化的质粒pα，pβ，pγ，γ-PDS，pγ-BRI1A和pγ-BRI1B mMachine T7体外转录试剂盒协议。在1％琼脂糖上检查制备的加帽的转录物凝胶。任何较小条带的拖尾指示RNA的降解成绩单。应该有一个约10,000 bp的微弱带，亮带约3,000bp。
对于每个植物，VIGS 通过将9μlFES缓冲液与0.35μl每种混合来制备接种物 α，β和相关的基于γ的转录物[γ，γ-PDS（阳性对照），γ-BRI1A或γ-BRI1B]。 FES缓冲液用作模拟处理。
通过摩擦接种10日龄幼苗的第一叶与10μl的转录混合物或FES（模拟处理）之间拇指和食指。注意不要损坏叶片。
14天后，评估植物的基因的视觉症状沉默。在PDS沉默的植物的情况下，叶子出现照片漂白（图1）。 BRI1 沉默的植物表现出矮小的症状，如图2所示。

图1.大麦中PDS基因的沉默导致光漂白并导致叶片变白。 A. FES 处理（阴性对照）B.BSMV：00（模拟处理）C.BSMV：PDS （正控制）。

图2. Hv BRI1 的静音导致了在大麦植物中植物生长的发育迟缓。 A。 FES治疗（阴性控制）B.BSMV：00（模拟处理）C.BSMV：HvBRI1
至确认沉默，收获3号叶并快速冷冻液N 2并在RNA提取之前储存在-70℃。总RNA为提取自植物使用由TrizolTM提供的方案制造商。
通过实时RT-PCR定量基因沉默使用对BRI1（HvBR1：RT，表1）特异性的引物和相对于 RNA解旋酶管家基因（HvRNAH，表1）。注意：对于设计基因片段外的实时引物是重要的将其克隆到pY质粒中。

笔记

应注意不要将γ-PDS与其他γ样品混合。
每次治疗都必须更换手套
当将成绩单应用于叶片时，请不要过度损坏叶片以使其温和。

食谱

5x GP缓冲液（500ml） 18.77g甘氨酸
26.13g K 2 HPO 4二价
用ddH 2 O转至500ml，立即使用
FES缓冲液（500ml）
100 ml GP缓冲液
5克焦磷酸钠十水合物 5克膨润土
5克celite
用ddH 2 O 2加到500ml/dm 2 等分成50ml体积并高压灭菌（121℃20分钟）等分试样可以在室温下在无菌条件下保存

致谢

这项工作得到了科学基金会爱尔兰研究基金（IN10/IN.1/B3028）和农业研究刺激剂研究部RSF 07 513的支持。部分程序改编自之前描述的方法，Ali等人（2014），Holzberg等人（2002）和Scofield等人（2005）。

参考文献

Ali，S.S.，Gunupuru，L.R.，Kumar，G.B.，Khan，M.，Scofield，S.，Nicholson，P.and Doohan，F.M。在油菜素类固醇受体BRI1中修饰的uzu大麦品系中植物病害抗性增强。 em> BMC Plant Biol 14：227.

Holzberg，S.，Brosio，P.，Gross，C。和Pogue，G.P。（2002）。在单子叶植物中大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默植物J 30（3）：315-327。

Scofield，S.R.and Brandt，A.S。（2012）。使用大麦条纹花叶病毒载体在六倍体小麦中病毒诱导的基因沉默。 In：Watson，J.M.and Wang，M.B。（eds）。 Antiviral Resistance in Plants：Methods and protocols。 Springer，93-112。

Scofield，S.R.，Huang，L.，Brandt，A.S。和Gill，B.S。（2005）。开发一种病毒诱导的六倍体小麦基因沉默系统及其在功能分析中的应用的 - 介导的叶锈病抗性途径。植物生理学 138（4）：2165-2173。