材料和试剂

Fusarium culmorum 菌株FCF 200（由Paul Nicholson提供， https： //www.jic.ac.uk/directory/paul-nicholson/）
马铃薯葡萄糖琼脂（Difco，目录号：213400）
绿豆（任何杂货店）
John Innes堆肥No 2（Westland园艺）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）
肥料NPK 10-10-20（Agrifert）
琼脂（OXOID，目录号：LP0013）
滤纸（Whatman，目录号：1001-090）
绿豆汤（见配方）

设备

KOVA Glasstic Slide 10（KOVA International Inc.，目录号：87144）
硅管（直径0.5cm）
植物生长室
-70℃冷冻器（Thermo Scientific Revco PLUS）
摇动培养箱（New Brunswick Scientific，型号：I26）
光学显微镜（Leica Microsystems，型号：DM3000）
玻璃屋（CambridgeHOK containment glasshouse）[22°C; 最大温度为27℃，在16小时/8小时（700μmol/m/s）/夜间条件下的最小光强度为700μmol/m 2/s，在20/12℃下最佳的16小时/8小时（700μmol/m/s）/夜）

程序

真菌分生孢子接种物的制备
1. 存储 F。大肠杆菌在-70℃在10％（vv <-1）甘油中的菌丝体。之前使用，将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上的镰孢分离物培养并在25℃下培养7天
2. 对于分生孢子，接种3-4个PDA琼脂塞在100ml锥形瓶中，含有25ml 绿豆肉汤培养基（见Recipes）并以200rpm培养培养物，并在25℃，无光照下5天。
3. 通过分生孢子悬浮液通过两层无菌奶酪布洗涤三次次，用无菌蒸馏水。重悬在0.2％Tween 20中的分生孢子并使用一次性KOVA Glasstic载玻片测定浓度 10.将浓度调节至2×10 6孢子/ml 0.2％吐温20 注意：对于使用KOVA Glasstic幻灯片的孢子计数，确定每个小网格的平均孢子数，并乘以90,000得到数孢子/ml。
镰刀菌苗枯病
1. 将大麦种子放在含有2片过滤器的9cm培养皿中纸（90mm直径），用6ml无菌蒸馏水浸泡
2. 用铝箔覆盖培养皿，在4℃下在黑暗中分层2天
3. 转移板21°C在黑暗中2天，以促进发芽
4. 将胚芽转移到包含John Innes的6厘米直径的锅中堆肥No 2并放置2cm长的无菌硅管（0.5-cm直径）作为围绕茎基部的颈圈
5. 将植物放在气候控制的增长室在22℃在长日照条件下（16 h/8 h），每隔一天底部浇水。相对湿度维持在70％。
6. 接种10日龄的茎基幼苗用400μlF。大肠杆菌悬浮液[1×10 6个孢子/ml 0.2％吐温20的1％（wv < - sup>）琼脂]中。处理模拟控制植物用含有0.2％吐温20的1％琼脂注意：准备2％（wv-sup）无菌琼脂溶液中并使其达到50℃。混合孢子悬浮液（2×10 6个孢子/ml）和琼脂溶液以1:1的比例混合。
7. 在12天时对茎上可见的疾病症状（图1）进行评分使用以下疾病评分系统进行后接种：FSB疾病分数是病变长度（cm）与病变颜色（病变）的乘积色标：0，无病; 1，非常轻微的褐色坏死; 如图2所示，轻微/中度褐色坏死; 3，广泛的褐色坏死; 如图4所示，广泛的黑色坏死）（Nicholson等人，1998）。
8. 重复实验三次，每次包括三个重复盆（每个含有两株植物）。
  
  图1.显示镰孢属（栽培品种Lux）的症状的大麦幼苗。将10天龄的幼苗用以下处理：将0.2％吐温20 和1％（wv -1）琼脂，或大刀镰孢（Fusarium culmorum）（菌株FCF 200）的B分生孢子在0.2％Tween 20和1％琼脂中。疾病症状（茎的褐变碱基）在处理后12天可视化。
镰孢属枯萎病
1. 如上所述对镰孢幼芽枯萎实验发芽大麦种子。
2. 转移发芽的种子到包含约翰的15厘米直径的锅 Innes堆肥No 2.在温室里种植植物。加入2g NPK 10-10-20肥料施用于生长阶段的每个罐（GS; Zadoks等人， 1974）20和30.
  注意：有关不同Zadoks的详细信息成长阶段请前往 http://www.cerealcentral.ca/crop-management_cereal-staging.aspx 。
3. 通过注射4μl分生孢子来处理头部在中期（GS 65）悬浮液（5×10 4孢子/ml 0.2％吐温20）或模拟0.2％吐温20 处理成一个头的四个中小穗的每一个。
4. 立即用聚乙烯袋覆盖治疗头48小时，以促进镰刀菌感染。
5. 评分FHB疾病症状（图2）（漂白的百分比小穗/头），GS 70,80和90，计算下面的面积疾病进展曲线（AUDPC）[如Shaner和Finney所述（1977）]。
  
  其中，Yi 是疾病进展的评估（观察时， ti 的百分比漂白小穗数）在观察时的时间（天），以及 n 观察（Shaner和Finney，1977）。
6. 成熟时（GS 91），收获谷物头，冷冻干燥48小时，并确定数量和每个头中的颗粒重量。使用此数据计算1,000 颗粒重量。
7. 温室FHB疾病试验应该进行至少两次，每次试验至少应包括5次每个处理组合安排的复制植物（每株植物2头）在随机布局中
  
  图2.镰孢属枯萎病的症状在大麦（栽培品种Akashinriki）中。注射四个中部小穗与4μl的大刀镰孢（Fusarium culmorum）（菌株FCF 200）的分生孢子悬浮液在0.2％吐温20或B 0.2％吐温20中漂白的小穗/头）和AUDPC得分在GS80。白色箭头表示接种点。

食谱

绿豆汤
煮20克/升绿豆在蒸馏水中20分钟
将肉汤通过两层奶酪布，并使体积达到1 L
在121℃下高压灭菌15-20分钟

致谢

这项工作得到了科学基金会爱尔兰研究基金（IN10/IN.1/B3028）和农业研究刺激捐赠基金RSF 07 513的支持。

参考

Agostinelli，A.M.，Clark，A.J.，Brown-Guedira，G。和Van Sanford，D.A。（2012）。优化镰刀菌抗虫抗性的表型和基因型选择在小麦中。 Euphytica 186（1）：115-126。
Ali，S.S.，Gunupuru，L.R.，Kumar，G.B.，Khan，M.，Scofield，S.，Nicholson，P.and Doohan，F.M。在油菜素类固醇受体BRI1中修饰的uzu大麦品系中植物病害抗性增强。 em> BMC Plant Biol 14：227.
Ali，S.S.，Kumar，G.B.，Khan，M。和Doohan，F.M。（2013）。油菜素类固醇增强抗大麦镰刀菌病的能力。植物病理 103（12）：1260-1267。
McMullen，M.，Jones，R。和Gallenberg，D。（1997）。小麦和大麦的疤痕：一种重新出现的破坏性影响疾病。 a> Plant Dis 81（12）：1340-1348。
Nicholson，P.，Simpson，D.，Weston，G.，Rezanoor，H.，Lees，A.，Parry，D。和Joyce，D。（1998）。大镰刀菌和禾本科镰孢菌的检测和定量使用PCR测定法在谷类中进行。 Physiol Mol Plant Pathol 53（1）：17-37。
Shaner，G.and Finney，R。（1977）。氮施肥对诺克斯慢霉病抗性表达的影响小麦。 Phytopathology 67（8）：1051-1056。
Simpson，D.R.，Thomsett，M.A。和Nicholson，P。（2004）。 Microdochium nivale var。 majus ， nivale var。 1）：79-87。
Walter，S.，Nicholson，P.and Doohan，F.M。（2010）。镰刀菌赤霉病病毒中宿主和病原体的作用和反应。/a> New Phytol 185（1）：54-66。
Zadoks J.C.，Chang T.T.和Koznak C.F. （1974）。谷物生长阶段的十进制代码。 Weed Res 14（6）：415-421。