材料和试剂

pBSM13 ⁺（Stratagene）
T3 RNA聚合酶（Roche Diagnostics，目录号：P2083）
10x转录缓冲液（Roche Diagnostics，目录号：P2083）
高保真PvuII（PvuII-HF）（New England Biolabs，目录号：R3151L）
高保真EcoRI（EcoRI-HF）（New England Biolabs，目录号：R3101L）
10x CutSmart缓冲液（New England Biolabs，目录号：R3101L）
6x凝胶上样染料（New England Biolabs，目录号：R3101L）
NdeI（New England Biolabs，目录号：R0111L）
T4多核苷酸激酶（PNK）（New England Biolabs，目录号：M0201L）
10×T4多核苷酸激酶缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0201S）
RNase（RNase抑制剂）（New England Biolabs，目录号：M0307L）
RNase（无DNA酶）（Roche Diagnostics，目录号：11119915001）
无核糖核酸酶DNase I（Affymetrix，目录号：784111000）
Pfu DNA聚合酶（Agilent Technologies，目录号：600353）
10x Pfu缓冲液（Agilent Technologies，目录号：600353）
核糖核苷三磷酸组（Roche Diagnostics，目录号：11277057001）
脱氧核苷三磷酸（dNTP）（Roche Diagnostics，目录号：11969064001）
γ-[sup-32P] ATP（PerkinElmer，目录号：Blu502A001MC）
G-25宏旋转柱（最适合体积为75-150μl）（哈佛仪器，目录号：74-3901）
RNeasy RNA纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：74104）
苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（Amresco，目录号：K169-400ML）
乙醇（VWR Lifesciences，目录号：EM1.00967.4003）
3M醋酸钠（Amresco，目录号：E521-100ML）
异丙醇（J.T.Baker ，目录号：9037-03）
40％丙烯酰胺 - 双丙烯酰胺（19:1）溶液（VWR International，目录号：JT4968-0）
40％丙烯酰胺 - 双丙烯酰胺（29:1）溶液（VWR International，目录号：JT4968-0）
尿素（VWR International，目录号：97061-926）
过硫酸铵（VWR International，目录号：97064-594）
HIV逆转录酶[如Hou等人（2004）所述纯化]
Milli-Q质量[RNase，无酶水（dH2O）]
DNA寡核苷酸从Integrated DNA Technologies获得
延伸反应缓冲液（参见配方）
洗脱缓冲液（见配方）
2x SDS加样缓冲液（见配方）

设备

Eppendorf管
微量移液器
培养皿
台式离心机
孵化器
凝胶装置

程序

底漆标签
1. 所有引物应首先在50μl1×PNK缓冲液中放射性标记连同50皮摩尔的每种引物，10μl[γ-32 P] ATP和5μl 单位的多核苷酸激酶（PNK）。将反应混合物温育在37℃温育30分钟，PNK在65℃热灭活15分钟 ℃。
2. 将G-25离心柱与500μldH 2 O孵育15分钟以平衡柱，并通过旋转除去过量的水柱子在台式离心机以5000rpm离心4分钟
3. 热灭活后，从中除去过量的[γ-32 P] ATP 反应混合物通过加载到平衡柱上并旋转在5,000rpm下4分钟。
保真度测定的RNA的制备
1. 得到用作保真度测定的模板的转录物来自质粒pBSΔPvuII1146，其按照描述制备 DeStefano等人（1998）。
2. 对于RNA的制备，质粒用50单位的酶NdeI在NEB缓冲液4中切割在37℃下孵育3小时。然后用苯酚提取裂解的质粒氯仿萃取，乙醇沉淀回收
3. 裂解后，跑出转录在100μl的转录缓冲液中与2μg的转染缓冲液一起进行线性化质粒，5μl100mM DTT，10μl5mM核糖核苷酸， μl的RNA酶抑制剂和40单位的T3 RNA聚合酶在37℃下3小时 C。
4. 向反应混合物中加入10单位DNA酶I 将反应物温育10分钟以消化剩余的DNA。
5. 然后使用QIAGEN RNeasy试剂盒纯化RNA 制造商的说明书，并使用分光光度计量化。
RNA指导的DNA合成
1. 使用上述方法制备的约760nt的RNA模板与放射性标记的25-nt DNA引物杂交（5'-GCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAG-3'）
2. 对于杂交，将引物加入25nM的模板（2:1比例的引物：模板）在48μl的延伸反应缓冲液中以及6mM MgCl 2和100μMdNTP。将混合物在65℃下加热5分钟然后缓慢冷却至室温。总反应体积为50 μl。
3. 将引物 - 模板在37℃孵育3分钟。 2μl 的5μMHIV RT以引发延伸反应，
4. RNA指导的DNA合成
  1. 使用上述方法制备的约760nt的RNA模板与放射性标记的25-nt DNA引物杂交（5'-GCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAG-3'）
  2. 对于杂交，将引物加入25nM的模板（2:1比例的引物：模板）在48μl的延伸反应缓冲液中以及6mM MgCl 2和100μMdNTP。将混合物在65℃下加热5分钟然后缓慢冷却至室温。总反应体积为50 μl。
  3. 将引物 - 模板在37℃孵育3分钟。 2μl 的5μMHIV RT以引发延伸反应，... 的合成。来自DNA指导合成的产物看起来更暗凝胶比第一轮的产品使用的是引物此步骤具有较高的比活性
  4. 30分钟后，1 加入100μlRNase以消化剩余的RNA，样品为加热至65℃5分钟以使RT失活
  5. DNA产物然后通过标准苯酚氯仿萃取回收。等于体积（50μl）苯酚：氯仿：异戊醇混合物（25:24:1）加入到反应中。将反应物充分混合，然后旋入微量离心机在18,000rpm离心3分钟。水层从移去顶部，转移到新管中并加入等体积（〜50μl）的氯仿。将混合物在18,000rpm下再次旋转3分钟在微量离心机中，小心地除去水层移动到一个新的管。
  6. 使用标准物沉淀DNA产物乙醇沉淀。加入两倍体积的100％乙醇（100μl）加入十分之一体积（5μl）的3M乙酸钠并进行反应在-20℃下贮存2小时
  7. 两个小时后，反应以18,000rpm旋转20分钟。上清液仔细丢弃。沉淀用500μl70％乙醇洗涤然后干燥
  8. 将沉淀重悬于2x上样缓冲液中并在6％变性7M上分离产物脲 - 聚丙烯酰胺凝胶
  9. 从中切出199nt DNA产物凝胶，将凝胶碎片粉碎并重悬于500μl洗脱液中缓冲。在4℃过夜洗脱后，将物质过滤通过0.45μM注射过滤器，并使用回收DNA产物苯酚氯仿萃取法。
  10. 的将回收的产物重悬浮在洗脱缓冲液中，使用a 分光光度计，并用作DNA定向DNA的模板合成步骤。
5. DNA指导DNA合成
  1. 将从RNA定向合成回收的DNA产物杂交到另一个20nt放射性标记的DNA引物（5'-AGGATCCCCGGGTACCGAGC-3'）具有至少10倍大的特异性活性比用于第1轮的引物（见上文）。
  2. 一秒如上所述进行一轮DNA合成，反应体积为25μl。保持延伸条件在RNA和DNA模板延伸反应中相同。
  3. 用25μl2x加样缓冲液和产物终止反应在8％变性7M尿素 - 聚丙烯酰胺凝胶上凝胶纯化。
    注意：凝胶运行足够远，可以有效地分离162-nt 从199-nt模板中完全扩展产品2（图2）。
  4. 定位162nt的产物并从凝胶切出。产品如上所述回收并重悬于100μl洗脱液中缓冲。
6. PCR反应
  1. 通过扩增在上述步骤中产生的第2轮DNA PCR使用以下引物：5'-GCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAG-3'和 5'-AGGATCCCCGGGTACCGAGC-3'。
  2. 第一个引物是用于的 RNA指导的DNA合成和第二引物与区域重叠的原始RNA的质粒上的EcoRI位点转录。
  3. 在购买的1x中进行PCR反应 Pfu缓冲液连同200μMdNTP，50皮摩尔每种引物，和5 单位的Pfu聚合酶。 5μl来自DNA定向DNA的产物合成用作模板。总反应体积为50μl 注意：初始变性步骤在95°C（5分钟），然后在94℃（1分钟），50℃（1分钟），72℃（1分钟），最后在72℃孵育5分钟。
  4. 的来自PCR反应的水相是酚 - 氯仿萃取的通过如上所述的乙醇沉淀回收
  5. PCR产物用EcoRI和PvuII各30单位在总共75μlCutSmart缓冲液中在37℃消化1小时。
  6. 向每个反应和样品中加入15μl6x凝胶负载染料在12％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳
  7. 通过UV遮蔽定位DNA，通过过夜洗脱回收，并使用分光光度法定量回收DNA 在使用底漆制备插入物之后延伸反应和PCR反应，质粒载体如DeStefano（2010）所述制备。插入连接质粒载体，连接质粒转化到GC-5大肠杆菌细胞中，如DeStefano（2010）中所述。然后计数蓝色，淡蓝色和白色菌落，并计数菌落使用每个的数目确定RT的突变频率群落。
    注意：所有插入或缺失移码突变和大多数替代突变由RT引入 RNA指导或DNA指导的合成步骤将导致微弱蓝色或白色殖民地。淡蓝/白的数量比菌落到总菌落数将给出菌落突变频率（CMF）。例如：在6mM Mg ^{2 +} 进行的实验中，连同3605个蓝色菌落一起获得32个淡蓝色/白色菌落给出8.8×10 ^-3 的CMF值。
食谱
1. 延伸反应缓冲液（50ml）
  
  1 M Tris HCl（pH 8）
  25 ml
  
  3 M KCl
  13.3毫升
  
  1 M DTT
  1ml
  
  无RNase水
  10.7 ml
2. 洗脱缓冲液（50ml）
  
  1 M Tris HCl（pH 7.5）
  500微升
  
  0.5 M EDTA
  100微升
  
  无RNase水
  49.4毫升
3. 2x SDS上样缓冲液（10ml）
  
  50mM Tris HCl pH6.8 500微升
  
  100 mM DTT
  1 ml
  
  2％SDS
  2 ml
  
  0.05％溴酚蓝色
  500微升
  
  10％甘油 1 ml
  
  无RNase水
  5 ml
参考文献
1. Achuthan，V.，Keith，B.J.，Connolly，B.A。和DeStefano，J.J。（2014）。人体免疫缺陷病毒逆转录酶在体外生理镁条件下显示出更高的保真度。 J Virol 88（15）：8514-8527。
2. DeStefano，J.J。（2010）。反应条件和3AB对脊髓灰质炎病毒RNA依赖性RNA聚合酶的突变率的影响，互补测定。 Virus Res 147（1）：53-59。
3. DeStefano，J.，Ghosh，J.，Prasad，B.and Raja，A。（1998）。人类免疫缺陷病毒逆转录酶催化的内部链转移的高保真度。 J Biol Chem 273（3）：1483-1489。
4. Hou，E.W.，Prasad，R.，Beard，W.A。和Wilson，S.H。（2004）。高度表达和纯化未标记和组氨酸标记的HIV-1逆转录酶。 Protein Expr Purif 34（1）：75-86。