材料和试剂

拟南芥信息服务集合中的拟南芥 Col-0生态型种子（ www .arabidopsis.info ）
哈茨木霉CECT 2413（西班牙型培养物保藏中心，西班牙瓦伦西亚）[本文中称为T34是本工作中使用的菌株。 T。 harzianum T34在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上生长，孢子在-80℃下在30％甘油溶液中维持]/
Murashige& Skoog培养基（MS），包括B5维生素（Duchefa Biochemia，目录号：M0255.0050）
蔗糖（Applichem Panreac，目录号：141621.1211）
85％氢氧化钾粒料（KOH）（Applichem Panreac，目录号：141515.1210）
0.15％琼脂糖（Conda Pronadisa，目录号：8016）
0.39％马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（Sigma-Aldrich，目录号：P2182）
0.24％马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）（Sigma-Aldrich，目录号：P6685）
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（Conda，目录号：1022.00）
马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）（Difco，目录号：254920）
玻璃棉洗涤QP（Panreac，目录号：211376.1208）
Resma滤纸（420×500mm）（Auxilab S.L，目录号：80250452）
液氮（液空）
乙醇（Panreac，目录号：161086）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
次氯酸钠
灭菌溶液（参见配方）
MS Medium（请参阅配方）
洗涤液（见配方）

设备

无菌蒸馏水纯化系统（EMD Millipore，型号：ELIX35）
品牌棉粗纱（Sigma-Aldrich，目录号：BR28205）
无菌不锈钢筛（Alunet，目录号：174562）
外科微孔胶带（3M，目录号：1530-0）
1.5ml微管（Deltalab，目录号：200400P）
冷室
Phytatray II盒[114mm，86mm，102mm（W×D×H）]（Sigma-Aldrich，目录号：P5929）
层流柜（Telstar，型号：AV-100）
植物生长室AGP-1400-HR（Radiber SA）
Shaker Certomat R（B.Braun，型号：986302/4）
培养皿（90×14mm）（Deltalab，目录号：200209）
外科医生碳钢（手术刀无菌）（Jai Surgicals，目录号：0835147）
1.5毫升玻璃棉（自制）微管
15ml管（Deltalab，目录号：401402）
Thoma细胞计数室（BRAND，目录号：7180 05）
盖玻璃EUROTUBO（22×22mm）（Deltalab，目录号：D102222）
光学显微镜（Leica Microsystems AG，型号：DC300F;目录号：10447115）
锥形瓶（Thermo Fischer Scientific，目录号：11972233）
Kühner摇床（Thermo Fisher Scientific，型号：ISF-1-W）
真空/压力泵PALL（生命科学，型号：DOA-P730-BN）
安全玻璃（真空瓶，10ml移液管和树胶）（自制）
X5刻度移液管（类型1，B类，ISO 835）（Thermo Fisher Scientific，目录号：11912178）
医用级硅胶管（1x 1.5，内径x外径）（Deltalab，目录号：3500115）
橡胶塞（VWR International，目录号：217-9463）
钳（不锈钢，L = 105mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10458242）
真空瓶pirex（1,000ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12693182）
磁性过滤漏斗（VWR International，目录号：516-7590）
不锈钢剪刀170mm（Thermo Fisher Scientific，目录号：12693182）
冻干器Virtis Advantage（SP Scientific）

程序

拟南芥种子必须在播种前进行表面洗涤和灭菌。为此，将约200粒种子置于1.5ml微量管中，并加入1ml洗涤溶液。在室温下在振荡器（Kühner摇床）中摇动种子30分钟。取出洗涤液。加入1ml灭菌溶液。在室温下再摇动10分钟。取出灭菌溶液，用无菌蒸馏水倒置四次，洗涤种子。最后，将种子置于1.5ml微管中，并在4℃在冷室中保持分层3天，以便打破种子休眠并同步发芽。
在层流箱中，在无菌不锈钢筛网（图1和2）上的无菌纱布片上用50ml液体MS培养基将Phytatray II箱内的拟南芥种子放置在琼脂糖水溶液中0.15％）以单独播种种子。

图1.在Phytatray II盒中的无菌不锈钢筛网上设置无菌纱布片

图2.显示Phytatray II盒中水培培养物的照片
用于传播 T。在具有PDA的培养皿上生长并形成孢子，在室温下培养至少7天，以实现用孢子完全覆盖板表面。
为了收获孢子，向平板中加入5ml无菌蒸馏水。过滤此悬浮液在1.5毫升微玻璃棉管，置于15毫升管，以去除痕量的菌丝体微管（图3和4）。孢子保持在4℃不超过1周。最后，通过使用下式通过用100μl的1:100稀释液移液来确定Thoma细胞计数室中的孢子浓度：

：这是在四个不同象限中计数的孢子的平均值。
最后，将孢子保持在4℃直至使用

图3.在放置在15 ml管上的微量管中设置玻璃棉

图4. T的收获。 harzianum 孢子
使用 T的孢子。 harzianum（10×10 6孢子）接种到含有100ml PDB的250ml烧瓶中。保持培养在25℃和200 rpm下48小时。通过过滤收集菌丝体（约250mg）（过滤系统：真空/压力泵PALL，安全玻璃，橡胶塞，真空烧瓶小瓶和磁性过滤漏斗）。通过磁性漏斗用100ml无菌水洗涤菌丝体（图5）。使用洗过的菌丝体接种含有生长21天的拟南芥植物的Phytatray盒。通过在无菌镊子的帮助下提起拟南芥幼苗所在的不锈钢筛网接种菌丝体（图6）。将菌丝体放在MS培养基上并摇动（振荡器Certomat R）以促进分散。

图5.设置收获孢子的过滤系统

图6.将菌丝体接种到Phytatray盒中的程序
最后，在长日照条件下（16小时光照/8小时黑暗），在具有40％湿度的植物生长室中在80rpm和22℃下保持水培培养20天（光强度为80至100μE/2 /s）。然后，使用无菌剪刀在层流柜上回收根。用无菌水清洗根以除去菌丝痕迹。在滤纸上干燥根，最后在液氮中冷冻。冻干使用a 冻干机Virtis优点，直到根部的水被完全清除。收集的样品准备用于核酸提取或qPCR程序。根入侵的成功通过qPCR分析。相应的方案在Alonso-Ramírez等人（2014）中描述。

食谱

灭菌溶液
2.5％次氯酸钠
0.005％Triton X-100 dH 2 2 O
MS介质
9g Murashige& Skoog培养基，包括B5维生素，1 L
1％蔗糖用KOH调节pH至5.7 Qs。 dH <2> O 1 L
使用高压灭菌器在120℃/1atm下灭菌20分钟
洗涤溶液
70％乙醇
1％Triton X-100 dH 2 2 O

致谢

研究项目资金来自Junta de Castilla yLeón（SA260A11-2）和西班牙国家项目MICINN（AGL2009-13431-C02）和MINECO（AGL2012-40041-C02-01）。

参考文献

Alonso-Ramirez，A.，Poveda，J.，Martin，I.，Hermosa，R.，Monte，E。和Nicolas，C。水杨酸可防止木霉的木霉进入根系的血管系统。/a> Mol Plant Pathol 15（8）：823-831。