材料和试剂

拟南芥的玫瑰花叶片（哥伦比亚，3周）
AlCl 3（Sigma-Aldrich，目录号：237051）
CaCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
HCl（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
FDA（Sigma-Aldrich，目录号：596-09-8）

材料和试剂

拟南芥的玫瑰花叶片（哥伦比亚，3周）
AlCl 3（Sigma-Aldrich，目录号：237051）
CaCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
HCl（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
FDA（Sigma-Aldrich，目录号：596-09-8）

NaCl (Sigma-Aldrich, catalog number: S6150)
Glucose (Sigma-Aldrich, catalog number: G7528)
Trition X-100 (Sigma-Aldrich, catalog number: T-8787)
Phenylmethylsulfonyl fluoride (Sigma-Aldrich, catalog number: P7626)
Tris (Sigma-Aldrich, catalog number: T1378)
SDS (Sigma-Aldrich, catalog number: L6026)
（Sigma-Aldrich，目录号：A3426），br /（NH 4）2 SubS 2 O 8 >
TEMED（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
SuperScript II第一链合成系统（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11904-018）
SYBR Premix Ex Taq（Takara，目录号：RR420A）
Bio-Rad蛋白测定试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0001）
抗AOX抗体（Agrisera，目录号：AS10699）
抗Rubisco抗体（Agrisera，目录号：AS03037）
抗兔IgG（Dylight？sup？800 4x PEG缀合物）二抗（CST，目录号：5151）
抗小鼠IgG（Dylight TM sup TM 800 Conjugate）二抗（CST，目录号：5257）
酶溶液（见配方）
W5解决方案（参见配方）
5mM AlCl 3在Ca培养基中的溶液
实时PCR反应溶液（参见配方）
裂解缓冲液（见配方）
10ml分离凝胶（见配方）
6 ml堆叠凝胶（见配方）
TBST（参见配方）

设备

pH计
热循环仪（Roche，型号：Light Cycler 2.0）
共聚焦激光扫描显微镜（Carl-Zeiss，型号：LSM510/ConfoCor2）
自动酶标仪（Tecan Trading AG，型号：无限M200）
双色红外成像系统（Odyssey，型号：9120）
离心机
轨道振动器
PVDF膜（Bio-Rad Laboratories，目录号：162-0177）
尼龙网
96孔板
1.5 ml微量离心管
通用剃刀刀片
真空泵（Vacuubrand，型号：MZ 2C）
BioPhotometer（Eppendorf，型号：AG 22331）

软件

Image J 1.43软件

程序

准备拟南芥原生质体
1. 将来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）（3周）的健康莲座叶片用刀片切成小叶片（0.5-1mm）。
2. 在培养皿中用酶溶液覆盖叶子放置在连接真空泵的真空室中， 100 至400mmHg真空30分钟。然后叶子在黑暗中孵育3小时，在室温下不摇动
3. 将消化的样品通过75μm尼龙网过滤通过离心3分钟沉淀粗制原生质体滤液在100×g下在室温下进行
4. 将纯化的原生质体悬浮在W5溶液中。
拟南芥原生质体的治疗
1. 将10μl在Ca培养基中的AlCl 3溶液加入96孔板中的90μl原生质体溶液中。
2. 将原生质体在室温下在黑暗中孵育1小时
3. 将原生质体与50μM的FDA温育5分钟，通过共聚焦显微镜观察Al诱导的原生质体死亡（图 1）。
  
  图1.Al诱导的原生质体死亡。野生型的存活力（WT）拟南芥原生质体。原生质体（2× 10 /ml）与50μMFDA孵育并用共焦观察激光扫描显微镜。
RNA提取和定量RT-PCR
1. 根据制造商的说明书使用TRI试剂从拟南芥原生质体提取总RNA。
2. 通过使用测量A 260来测定RNA的浓度生物光度计。 4μgRNA用于逆转录PCR
3. 用SuperScript II第一链合成第一链cDNA qRT-PCR的合成系统。使用Eppendorf BioPhotometer 确定cDNA的浓度
4. 基因的转录物通过使用ACTIN2作为内源的定量RT-PCR进行分析控制。使用引物扩增AOX1a 基因 5'-ATGATGATAACTCGCGGTGGAGC-3'和5'-GCAACATTCAAAGAAAG CCGAATC-3'。 PCR 使用50ng cDNA和SYBR PCR Master Mix进行制造商的协议。对于定量RT-PCR分析，光 Cycler 2.0仪器用于运行两步程序。 PCR循环扩增条件为95℃30秒，随后40℃ 95℃5秒，55℃30秒的循环
5. 使用2 ^{（ - ΔΔCt）}分析方法计算相对表达水平
  
  图2.A1处理的WT原生质体中 AOX1a基因的基因表达水平的qRT-PCR分析
蛋白质提取和蛋白质印迹
1. 将处理的原生质体重悬于裂解缓冲液中，并在冰上温和振荡在水平振荡器上孵育30分钟。
2. 将样品在4℃下以1,2000×g离心5分钟，将上清液转移到新的1.5ml管中。
3. 蛋白质浓度通过Bradford方法使用测定牛血清白蛋白作为标准（Bio-Rad蛋白测定试剂盒）
4. 蛋白质提取物通过12％十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离
5. 将凝胶转移到PVDF膜上，然后电泳45分钟
6. 用含有5％脱脂乳的TBST封闭膜1小时
7. 将膜与抗AOX抗体或抗Rubisco抗体在4℃下温育过夜
8. 将膜用TBST洗涤三次（每次约10分钟）时间），然后与第二抗体[AOX：抗兔IgG （Dylight TM TM 800 4x PEG缀合物）二抗; Rubisco：抗老鼠 IgG（Dylight？sup？800 Conjugate）二抗] 2小时。
9. 当膜干燥时，通过使用Odyssey双色红外成像系统检测
  
  图3.蛋白印迹分析总AOX蛋白水平 Al处理的WT原生质体。用单克隆抗AOX 抗体
  使用Image J进行定量分析 1.43软件（图4）。有关如何使用Image J的分步指南此目的显示在补充数据1 中。
  
  图4.蛋白质印迹的定量分析。使用Image J软件进行定量分析。

食谱

酶溶液
1％-1.5％（w/v）纤维素R10
0.2％-0.4％（w/v）macerozyme R10
0.4M甘露醇 20 mM MES
20 mM KCl
10mM CaCl 2
0.1％（w/v）牛血清白蛋白 pH5.5
W5解决方案
154 mM NaCl 125mM CaCl 2。 5 mM KCl
5 mM Glc
15mM MES-KOH（pH 5.6）
5mM AlCl 3在Ca培养基中的溶液
5mM AlCl 3
30mM CaCl 2
pH 4.5
实时PCR反应溶液

SYBR预混料Ex Taq
10.0微升

PCR正向引物（10μM）
0.4μl

PCR反向引物（10μM）
0.4μl

cDNA
2.0μl

ddH sub 2 O
7.2微升
裂解缓冲液
15mM NaCl 1％Triton X-100 100mg/ml苯甲基磺酰氟
50mM Tris-HCl（pH8.0）

10ml分离凝胶

30％聚丙烯酰胺	4.0 ml
1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）	2.5 ml
10％SDS	100微升
10％（NH 4）2 SubS 2 O 8 sub	100微升
TEMED	10微升
ddH sub 2 O	3.29 ml

6 ml堆积凝胶

30％聚丙烯酰胺	1.0 ml
1 M Tris-HCl（pH 6.8）	0.75 ml
10％SDS	60微升
10％（NH 4）2 SubS 2 O 8 sub	60微升
TEMED	6微升
ddH sub 2 O	4.124毫升

TBST
10mM Tris-HCl（pH7.4） 150mM NaCl 0.1％Tween-20

致谢

该协议得到了长江学者和大学创新研究团队（IRT0829），国家自然科学基金委 - 广东省联合基金重点项目（U0931005）和国家高技术研究与发展计划（863计划） 2007AA10Z204）。该方案改编自以前的工作（Yamamoto等人，2002; Ye等人，2013; Sun 。，2012）。

参考文献

Liu，J.，Li，Z.，Wang，Y.and Xing，D。（2014）。过表达 ALTERNATIVE OXIDASE1a 可缓解铝诱导的线粒体依赖性程序性细胞死亡拟南芥中的植物毒性。 J Exp Bot 65（15）：4465-4478。
Li，Z.和Xing，D。（2011）。使用荧光技术的铝植物毒性诱导的线粒体依赖性程序性细胞死亡的机制研究。 J Exp Bot 62（1）：331-343。
Sun，A.，Nie，S.and Xing，D。（2012）。一氧化氮介导的维持氧化还原稳态有助于NPR1依赖植物由脂多糖引发的先天免疫。/a> Plant Physiol 160（2）：1081-1096
Yamamoto，Y.，Kobayashi，Y.，Devi，S.R.，Rikiishi，S。和Matsumoto，H。（2002）。铝毒性与线粒体功能障碍和植物细胞中活性氧的产生有关。 Plant Physiol 128（1）：63-72。
Ye，Y.，Li，Z.和Xing，D。（2013）。一氧化氮促进镉诱导的拟南芥程序性细胞死亡中MPK6介导的半胱天冬酶3样激活。植物细胞环境36（1）：1-15。