材料和试剂

报告基因种子（该方案使用在含有四个快速应激反应元件--4xRSRE：LUCIFERASE的四个拷贝的最小启动子控制下的萤光素酶开发）
Murashige和Skoog基础培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M0404）
Phytoagar（PlantMedia，目录号：40100072-2）
无菌一次性试剂槽（Corning，目录号：07-200-128）
漂白剂（Clorox浓缩，8.25％次氯酸钠）
盐酸（HCl）
化学图书馆（来源可能不同）
钾萤光素（Gold Biotechnology，型号：LUCK-1G）
¼强度MS介质（参见配方）
1mM荧光素（参见配方）

设备

微孔手术胶带（3M，型号：1530-0）
1.5ml管（SealRite，目录号：1615-5500）
带盖的96孔板：平底，无菌但不进行组织培养处理（SARSTEDT AG，目录号：82.1571.001）
滤纸（这里使用Whatman 1440 125，孔径无关紧要）
牙签
层流罩或生物安全柜（这里使用SterilGARD ii，贝克公司）
化学通风橱（这里使用圣查尔斯）
真空室
多通道移液器（2-20和20-200μl）（Rainin）
温控增长柜（这里使用Conviron，型号：GR48）
Charge-Couple设备相机（CCD相机; Andor DU434-BV CCD）
Dehesh lab Perl脚本（ http：//www-plb.ucdavis。 edu/labs/dehesh/dehesh-lab-code.html ）

软件

ANDOR Solis分析软件（Andor技术，v15， http://www.andor.com/scientific-software）
ImageJ图像分析软件（ http://imagej.nih.gov/ij/）

程序

准备
1. 同步萌发和提高发展一致性幼苗，预选择更大和更均匀大小的种子选择拟南芥（ Arabidopsis ）报道系种子沿着一张纸几次。最小的种子往往通过静电力粘到纸张上，可以很容易地丢弃注意：使用同时收获的种子，从下生长的植物相同的条件，也将提高幼苗的均匀性。
2. 高压灭菌过滤纸，牙签和过滤嘴200μl移液器。表面消毒大小选择的种子：
  1. 等分大约50-100微升大小选择种子在1.5毫升管与耐氯标签
  2. 在化学通风橱中，在装有约100毫升漂白剂的烧杯的真空室中，将开放的1.5毫升管置于支架中
  3. 向烧杯中加入3 ml HCl，关闭真空室
  4. 施加真空5-10秒以密封腔室。
  5. 2.5-3小时后，打开室（仍然在通风橱）和关闭盖1.5ml管。
3. 根据下面的配方准备固体1/4强度的MS培养基注意：此协议是在固体培养基上生长的种子，但是对在液体培养基中生长的植物进行类似的筛选。
镀种子
1. 将MS培养基倒入96孔板中。内无菌罩，倒熔融培养基进入无菌试剂池。根据需要设置多通道移液器体积+ 10％（对于100μl，设置为110）。从水库中取出介质一次排出96孔板1行注意：
  1. 中的气泡井使电镀种子困难。最小化的发生率气泡和填充不良的孔，（a）将移液管尖端触及角落在底部和侧面之间排出之前和（b）不排出媒体完全，只有第一站的多通道移液器。这个导致一些介质保留在移液管吸头中，但大大减少气泡。
  2. 如果您的工作速度不够快，媒体可能会固化储器或移液管尖端。为了避免这种情况，建议从开始 65℃培养基。如果它成为问题，只需弹出并更换提示或水库。
2. 将灭菌的种子倒在滤纸上。使用无菌牙签的润湿尖端，拾起并且每孔放置一个种子的96孔板注意：这允许第二次机会种子大小选择。我们观察到之间的显着差异边缘孔，板边缘和内部孔的反应。你应该测试这个差异，如果有必要不适用处理或测量边界井。如果边界井不被测量然后将任何剩余的较小种子放在这些，使用均匀较大种子用于内部井。
3. 96孔板的带边缘用微孔外科胶带保持无菌和湿度。
幼苗生长
1. 在4℃黑暗中将种子分层3-5天
2. 在典型的拟南芥平板生长条件（22-24℃，16小时光照（60-80μE）/8小时黑暗）下生长幼苗。
3. 放置后6天，苗木应该扩大子叶和两个可看见的真实的叶子，准备好为治疗荧光素（图2A）。为了减少背景，最好继续荧光素处理18-24小时后成像注意：我们应用萤光素通过喷雾，用洗涤剂（见配方）。减少假阳性/阴性一个必须确保均匀的底物可用性饱和所有井。在筛选中，我们实现了这种均匀性从板上方约6英寸处喷射两次左侧和右侧的板，然后三个喷雾大约在板上方约9英寸从左到右跟踪。
成像
1. 在分层后7天，在成像前数小时将板从生长室移至实验室。
  注意：在4xRSRE的情况下：表达LUCIFERASE的幼苗，平板在中午8点前移动，在中午成像前4小时。这样做了最小化生理反应的调节，并通过延伸荧光素酶活性，与变化的植物环境相关。的移动和成像之间的时间间隔可以根据不同而不同实验的性质，但同时开始成像整个屏幕是可取的，因为可能的交互昼夜节律调节过程
  
  图1。组织化学模板板及相应处理板。在此示例中，化学模板的第2行用于处理两个样品板的行2和3，化学模板的行3 板用于处理两个样品板的行4和5，以及行4 化学模板用于处理两个样品的行6和7 板
2. 准备化学品1：稀释。它可能需要调整化学品的浓度库通过在水或其他适当的溶剂中稀释治疗，基于观察到的输出。在我们的实验中我们观察最佳工作浓度在20和40μM之间 - 几乎没有化学品任何可见的效应低于10μM。化学品可以10μl液滴形式使用在工作浓度到处理井;稀释每种化学品产生足以满足每孔12μl的总体积移液错误。
  注意：一些化学溶剂，如二甲基亚砜（DMSO），可能会影响输出信号。之前大规模屏幕，应该检查所需稀释水平的溶剂效果。我们建议使用"稀释溶剂"阴性对照，除了没有治疗控制，并在可能的情况下在每个板上进行阳性对照。
3. 准备化学品2：模板。准备一个化学模板板在冰上，与化学品的工作浓度相同布置，因为它们将被应用于治疗板。我们推荐将每种化学品应用于至少8个重复孔。这应该会产生至少6个合适的幼苗来测量反应。如果重复井被放置在列中，化学模板上的一行可以应用到治疗板上的多排（图1）注意：
  1. 如果不测试边界井，这必须反映在化学模板中。
  2. 用于每种化学处理的幼苗的数量应该是由感兴趣的系统的可变性和实用性决定约束，即要测试的化学品的数量。
4. 对待通过将化学物质从模板转移到处理板来培育幼苗使用多通道移液器。重要的是不要打扰幼苗 - 如果幼苗受到移液管尖端的伤害，它可能会改变化学品被感知，因此他们的反应。我们建议触摸移液管尖端向远离幼苗的一侧，靠近琼脂可能是为了使对侧面的飞溅或化学粘附最小化的井（图2B）。一旦所有化学品已被轻轻应用摇动板约5秒以确保孔中的化学分布均匀注意：在这种筛选技术中，没有定义植物如何吸收化学品。化学液滴可以从中吸收表面的琼脂通过下胚轴/子叶/叶，其中情况下感觉到工作集中。或者，化学品可以在化学扩散到介质中之后通过根部被吸收。在这种情况下，介质本身进一步稀释化学品感知浓度可以小到施加的工作的1/10 浓度（10μl化学品稀释到100μl培养基中）。
  
  图2.代表性的96孔板。（A）7天龄的幼苗。注意这套四口井装红，反映了两个潜力电镀问题。这组孔显示差的萌发导致植物太小，不能可靠分析，两个幼苗错误在一个孔中发芽（用*标记），消除它们用于分析。面板（B）显示多通道移液管化学应用
5. 成像条件将取决于记者使用，但我们建议成像时间达到典型响应的三倍，以允许作为化学扩散通过介质的延迟响应，等。我们使用了20小时时间过程中的CCD相机的五分钟曝光不透光盒，由ANDOR Solis v15图像分析控制软件（ http://www.andor.com/scientific-software ）。
分析/重新筛选
1. 根据响应的强度和均匀性，初始定性概述可能足以用于第一轮筛查然后进行定量分析（图3）
  1. 快速量化组合信息中每个的百分比幼苗的总面积是发光的，以及发光的亮度是，我们使用自定义Perl脚本来解释图像的ImageJ分析从ANDOR Solis v。15导出。注释脚本可在 http://www-plb.ucdavis.edu/labs/dehesh/。简而言之，这种技术需要用户在圆形的感兴趣区域（ROI）中放置网格 ImageJ软件使用插件Microarray Profiler。 ImageJ量化在这些ROI中的每个像素的"白"值，然后可以是标准化为植物面积。这种技术允许快速筛选大量的井，但它不区分模式的荧光素酶活性（即具有一些非零"白"的像素数）值）和发射光的强度（即"白"的大小）值）。
  2. 对于更定义的量化，小方形ROI可以使用ANDOR软件逐个放置在个体子叶上。这在实现时消除了发光面积的影响更高的强度精度。我们发现4像素乘4像素的ROI是一个七日龄拟南芥子叶的最佳大小。评论Perl 此分析的脚本也可在 http://www-plb.ucdavis.edu/labs/dehesh/。
    
    图3.模型数据展示了两种分析方法。显示的是同一组四个受伤的拟南芥幼苗在选择的时间点长达6小时。在方法（i），ROI网格（红色圆圈）适合每个整个幼苗。荧光素酶活性被定量为理论最大值的分数（时间点0的图像，对比度增强）。在方法（ii）中，正方形 ROI放置在单独的子叶上，提供更高的精度。
2. 一旦假定的化学"命中"已经通过第一轮确定筛选，他们必须在第二轮和可能第三轮确认。第二轮筛选应与第一轮类似，例外，我们建议至少增加一倍或最好增加三倍每个化学品的井数，其次是更多仔细定义响应的量化，如步骤E1b所述注意：在第一轮筛选中，我们发现约15％的筛选化学品，推定影响4x RSRE：LUCIFERASE 活动。第二轮筛选证实这些推定的〜10％化学品。这些数字应该根据不同而改变输出，记者的灵敏度和选择的化学文库。
3. 确认的化学品命中可能导致多种实验方法，包括浓度曲线以确定活性浓度，发展时间过程的化学效应，分析选择化学结构或已知功能类似，和/或分析化学效应对植物超越屏幕输出。

笔记

一般筛选记事

这里描述的屏幕输出是来自由含有四个拷贝的RSRE的最小启动子驱动的荧光素酶的发光，但是筛选技术可以应用于任何报道系统或对拟南芥幼苗的可见影响。只需替换任何预处理的荧光素应用，CCD相机/ANDOR软件的必要成像设备，以及适当的图像分析。
此屏幕设计用于观察化学处理的即时效应，避免长时间暴露时产生的任何副作用。然而，如果需要，可以将化学处理加入到熔融物中固体培养基，然后将种子置于各个孔中，或在拟南芥生长的任何期望阶段。
如果早期添加化学品，以及在用荧光素预处理期间，注意最小化污染风险（即使用无菌水，尽可能保持容器关闭，并且如果必要在无菌层流罩内工作）。污染可能直接或通过对植物健康的影响影响筛选输出

食谱

¼强度的MS媒体
在1L milli-Q纯H 2 O中溶解1.11g MS盐，并用NaOH调节pH至5.7 测量8 g phytoagar到瓶中，并倾注pH调节的MS溶液
高压灭菌，液体循环，30分钟
注意：虽然这里使用了1/4强度的MS培养基，但是½MS或其他植物生长培养基可能工作得很好或更好，应在筛选前进行测试。
1mM荧光素
准备10x（31.824mg/10ml）或100x（318.42mg/10ml）钾荧光素母液在milli-Q H 2 O中的量
在无菌H 2 O中稀释至1mM，加入Tween-20至终浓度0.01％

致谢

该协议是Bjornson等人（2014）中描述的扩展。这项工作得到国家卫生研究所（R01GM107311），国家科学基金会（IOS-1036491和IOS-1352478）和农业实验站（CA-D-PLB-3510-H）授予KD的支持。

参考文献

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Bjornson，M.，Benn，G.，Song，X.，Comai，L.，Franz，A.K.，Dandekar，A.M.，Drakakaki，G.and Dehesh，K。促分裂原活化蛋白激酶信号和 CALMODULIN-BINDING TRANSCRIPTIONAL ACTIVATOR3的不同作用调节植物一般胁迫应答的峰值时间和幅度。植物生理学166（2）：988-996。
Drakakaki，G.，Robert，S.，Szatmari，AM，Brown，MQ，Nagawa，S.，Van Damme，D.，Leonard，M.，Yang，Z.，Girke，T.，Schmid，SL，Russinova， E.，Friml，J.，Raikhel，NV和Hicks，GR（2011）。生物活性化合物簇在体内靶向动态内膜网络。 Proc Natl Acad Sci USA 108（43）：17850-17855。
Walley，J.W.，Coughlan，S.，Hudson，M.E.，Covington，M.F.，Kaspi，R.，Banu，G.，Harmer，S.L.and Dehesh，K。机械应激通过一种新颖的顺式元件诱导生物和非生物应激反应。 PLoS Genet 3（10）：1800-1812。