材料和试剂

酵母菌株：SF838-1Dα（MATαura3-52 leu2-3,122 his4-519 ade6 pep4-3gal2; Rothman和Stevens，1986）和THS4218（SF838-1Dα; HIS4his3Δ:: HygR ）
KOD热启动DNA聚合酶（EMD Millipore，由VWR International分销，目录号：80511-384）
DNA寡核苷酸引物（Integrated DNA Technologies，Inc。）
dpn I限制酶（New England Biolabs，目录号：R0176S）
适用于消化的限制酶（New England Biolabs）
PEG：聚（乙二醇），BioXtra avg。分子量3,350（Sigma-Aldrich，目录号：P4388-1KG）
乙酸锂二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：L6883-1KG）
ssDNA：来自鲑鱼睾丸的脱氧核糖核酸钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：D1626-1G）
GeneJET质粒小量制备试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：K0503）
从Arthrobacter leuteus （Amsbio LLC，目录号：120493-1）获得的Zymolyase ^® 100T。
One Shot TOP10化学感受态大肠杆菌（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：C4040-03）
注意：这些用作使用CCMB80缓冲液的进一步化学感受性程序的种子培养物。我们的感受态细胞通过用One Shot TOP10细胞接种1L SOB培养基培养物（Hanahan等，1991）在23℃下将它们生长至A600nm≈0.3。收获后，TOP10细胞通过如下所述（Hanahan等人，1991）处理而被制成化学感受态，其中"CCMB80 缓冲液"（10mM KOAc，pH 7.0,80mM CaCl 2 ^。
氨苄青霉素（终浓度为100μg/ml; Research Products International Corp.，目录号：A40040-100.0）和卡那霉素（终浓度为50μg/ml; Life Technologies，目录号：11815-024）
1M山梨醇，0.1M Na 2 EDTA（参见Recipes）
YPD液体介质（参见配方）
SOB培养基（参见配方）
SOC介质（参见配方）
LB板（含适当药物）（见配方）

设备

0.5mm玻璃珠（BioSpec Products，目录号：11079105）
离心机（Eppendorf微型离心机型号：5415D，目录号：022621408; Eppendorf转子，型号：F-45-24-11，用于24×1.5/2ml，目录号：022636502）
培养皿（100×15mm尺寸; VWR International，目录号：25384-088）
管（Axygen Microtubes 1.5ml透明，均聚物，防沸腾，目录号：MCT-150-C）
涡旋适配器（Microtube foam insert for Fisher Vortex Genie 2 mixer，Scientific Industries，Inc。;目录号：504-0234-00）
PCR机（MJ Research PTC-200Peltier Thermo Cycler，双30孔α块）

程序

开始时，设计寡核苷酸以允许以期望的顺序扩增每个必需的基因片段，表位或荧光蛋白标签，营养标记和/或耐药性盒及其重组装配（图1B）。后一个目的通过允许每个扩增片段通过HR连接到其邻居的每个引物上的同源性"[尾部] [通常30个核苷酸（Baudin等人，1993）]实现。重叠在质粒DNA中具有相应侧翼序列的C-末端最多片段的N-末端最多片段和3'-尾部中的5'-尾中的30个核苷酸的序列也足以重组插入载体。
可以使用基因组或质粒DNA（参见步骤3）作为模板作为模板扩增所需的片段序列。对于来自大多数商业试剂盒（参见材料和试剂）的纯化的质粒DNA，需要小于0.25μl作为模板DNA;对于染色体DNA，使用来自酵母的标准基因组DNA制备物（Amberg等人，2006），每50μLPCR反应推荐大约2-3μl。我们已经发现使用两相PCR方法实现具有突出尾部的PCR片段的最佳产生：在较低退火温度下5个循环，随后在较高退火温度下25个循环。为了确定初始温度，确定两个引物中的每一个的非突出部分的T m（以℃计）（为此目的，我们使用可在线获得的算法 http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html ），并且推荐的初始退火温度由公式[（T sub）^forward + T sub ^reverse/2] -5。为了确定第二温度，确定每个全引物的T m并应用相同的公式。根据DNA聚合酶，扩增的序列，热循环仪，甚至使用的管，PCR反应可能需要优化。关键点是需要产生预期长度的单个干净的PCR产物，因此，所得PCR产物的样品应该在DNA琼脂糖凝胶，以确保（i）产生正确大小的产物，和（ii）没有多个对应于引导错误的DNA条带。
如果任何序列扩增用作在E中繁殖的基于酵母的质粒的模板。大肠杆菌，随后用Dpn I（New England Biolabs）消化允许甲基化模板DNA的破坏，并且实际上消除了在选择标记物的情况下潜在的假阳性的恢复。构建的感兴趣的载体与模板DNA中包含的载体相同。用PCR管混合物（不需要缓冲液）在37℃下消化过夜（不需要热灭活）。
所需的目标酵母载体（图1B）应用单一独特的限制性内切核酸酶消化;此网站应该是已经存在于载体中的任何插入片段的下游。一种策略包括预先将启动子序列（5'-UTR）克隆到所需的基于酵母的质粒中（我们优选CEN载体）。
所得载体在启动子3'末端的消化应使用适当的限制酶进行并温育过夜。
注意：该消化的产物不必提取或凝胶纯化，因为即使未切割的载体将不会产生任何假阳性，只要用于选择所需构建体的标记（例如潮霉素抗性）不同于亲本质粒（例如，URA3）（然而，可能谨慎的是，通过在琼脂糖凝胶上运行小样品确保质粒已经线性化）。
导致所需质粒DNA的有效装配和随后的高产量的酵母菌株是SF838-1Dα（MATαura3-52 leu2-3,122 his4-519 ade6 pep4-3 gal2 ）（Rothman和Stevens， 1986）。然而，为了构建其中HIS3将是所选标记（而不是潮霉素抗性）的质粒，衍生的THS4218（SF838-1DαHIS4his3Δ:: Hyg ^R）。我们已经发现，从该背景的菌株中分离质粒可重复产生更高的质粒产量，并且比其他实验室菌株更可靠，包括BY4741（MATaleu2Δura3Δmet15Δhis3Δ）及其衍生物（Brachmann&特别是当与超化学性质的TOP10细菌转化（见下文）组合时。
酵母应在30℃下在富含（YPD）培养基中生长过夜至饱和，在10ml YPD中回稀释至A 600nm 0.25，并在30℃振荡下生长大致4-5小时直到A 600nm -1。对于通过这种体内连接程序的每种质粒构建，需要10ml培养物的酵母。因此，如果多个质粒构建同时进行，则需要相应的更多的培养物
通过在临床离心机中以6,000rpm离心5分钟收集酵母，并倒出YPD培养基。将所得沉淀重悬在500μl无菌水中，轻轻吹打，并在微量离心机中以6,000rpm再次沉淀1分钟。
对于酵母转化，应当使用修饰的基于乙酸锂的高效方案（Eckert-Boulet等人，2012）。为此，用移液管除去水，并将酵母沉淀重悬在500μl无菌的100mM乙酸锂溶液中，并以6,000rpm再收集细胞1分钟，除去上清液和保持酵母颗粒。
向每个酵母沉淀物中加入以下管：240μl50％聚乙二醇（PEG;高压灭菌并灭菌），36μl无菌1M乙酸锂，50μl10mg/ml单链鲑精DNA ssDNA在水中）。包含大量ssDNA以（i）用作转化的DNA的有效载体，和（ii）ssDNA在10mg/ml的浓度下是极粘的（并且可以聚集成阻碍通过微量移液管转移的球状物），因此，在将溶液吸移到每个管（或主混合物溶液）中时，显着量的损失。因此，为了确保包括足够的ssDNA，我们建议大约50μl，理解一些量将在溶液制备中损失。成分应按此顺序添加，首先将PEG溶液加入酵母中。或者，如果同时进行多次转化，可以将PEG，乙酸锂和ssDNA的"主混合物"混合在一起，并剧烈涡旋30秒，然后加入每个酵母颗粒。这些试剂的两个方面是重要的。首先，鲑鱼精子DNA的储备应煮沸10分钟，并在冰上冷却10分钟，每次使用。第二，如果使用"主混合"，对于每个实验必须是新的（它不能被存储和重复使用）。
加入适当的DNA片段（15-20μl来自每个PCR反应;浓度将取决于PCR反应的效率，片段的长度，但通常这对应于大约3-5μg的每个PCR反应）和切割载体（来自限制酶消化的15-20μl;以及约2μg总DNA含量，取决于所使用的亲本载体的大小）至乙酸锂和PEG处理的酵母的管中。以最大速度涡旋管30秒，将酵母重悬于溶液中，并在42℃下孵育45分钟。
收集酵母在微型离心机中以6,000rpm离心1分钟，去除上清液，轻轻地将酵母沉淀物重悬在550μl无菌YPD培养基中，并在30℃的培养箱中在架子中静置过夜。这种过夜孵育步骤对于使用药物抗性盒的任何构建体是绝对必需的（Kan等人，Nat Immunol或Hyg Immunol）;酵母需要足够的时间来表达药物 - 并且在它们被存在于选择培养基中的药物攻击之前变得抗性。与通过摇动或旋转通气相反，静置过夜孵育允许缓慢且大部分厌氧生长，从而降低CO 2和其它挥发物的产生速率，在我们的经验中，这些挥发物可以使盖子流出的标准Eppendorf管
将全管酵母涂布在合适的琼脂培养基（YPD +药物或合成的丢失培养基）上，并在30℃下孵育平板至少两天。任选的对照包括用（i）仅消化的载体和/或（ii）仅仅每个PCR片段转化相同的酵母菌株 - 两者都不应导致在选择平板上生成质粒构建体和不生长。
为了回收质粒DNA，将酵母从平板上刮下（避免琼脂） - 使用整个培养皿（直径150mm的培养皿;假设存在完整的覆盖草坪）的表面积的至少25％。理想地，这种高效率的体内连接技术与高效率酵母转化结合应该在选择性培养基上产生完全的草坪，尽管其它因素（例如，组装的复杂性）可以降低最终菌落计数。建议只使用在选择平板上产生充分覆盖的构建体进行方案。如果在初始选择平板上只有单个菌落，建议收集所有的菌落，并重新放在新鲜（选择性）平板上长出一个足够密实的酵母菌草坪，以便在本协议中使用。
将从平板上刮下的酵母重悬浮于500μl的1M山梨醇，0.1M Na 2 EDTA（pH 7.5）（Amberg等人，2006）中，短暂涡旋（最大速度）以确保完全再悬浮（预期溶液将非常稠和浓缩），然后将5-7.5μl储备液（终浓度为25mg/ml，在50％甘油中）的Zymolyase 100T（储存在4 ℃）。在37℃下在旋转器上孵育至少1小时（但不超过2小时）后，在微量离心机中以12,000rpm收集所得的原生质球。
去除上清液后，将原生质球沉淀物重悬浮于250μl专有细菌质粒分离溶液（参见材料和试剂）中。通过将溶液吸入和移出移液管来研磨;在这一点上，溶解的原生质球的溶液是非常粘的，并且需要大量的努力来确保非常彻底的重悬。
加入大致相等体积（大约100-250μl）的玻璃珠（直径0.5mm）。在微型离心机中以2,000rpm短暂旋转5秒（以确保所有玻璃珠与酵母溶液混合，而不是粘在管壁上）。最大涡旋5分钟（如果您平行做多个结构，可以使用可同时容纳多个管的涡旋适配器）。
玻璃珠裂解完成裂解后，继续您的首选商业细菌质粒分离方案的后续步骤 - 为Thermo Scientific系统，添加250μl"裂解缓冲液"，通过反转混合至少10次=和孵育在室温下5分钟。加入350微升的"中和缓冲液"，通过倒置至少10次立即混合。使所得溶液在微量离心机中最大（13,200rpm）离心5分钟
通过吸取含有上清液的溶液到新鲜的，标记的管中，并以最大速度离心另外2分钟（以去除任何残留的沉淀物/细胞碎片）转移。通过将澄清的上清液吸移到商业细菌质粒分离试剂盒（参见材料和试剂）中提供的质粒捕获旋转柱中来转移，以最大速度离心1分钟并丢弃流出物。
用商业乙醇洗涤溶液（500-750μl）洗涤离心柱，以最大速度离心1分钟，弃去流出液。重复（尽管此第二次洗涤步骤随商业质粒制备试剂盒而变化，并且可以是可选的）
为了除去任何残留的洗涤溶液，将空离心柱置于微量离心机中并以最大速度旋转1分钟，然后将离心柱置于新鲜的Eppendorf管中，通过加入25-30μl的由商业供应商提供的"洗脱缓冲液"，在室温下孵育1-2分钟，然后通过以最大速度离心2分钟收集洗脱液。
为了回收所需构建的质粒，将从旋转柱洗脱的含有DNA的溶液的样品（10μl）在含有100μl超化学感受态TOP10细菌细胞（材料和试剂）的管中温和混合， 80℃冰箱中，并在冰上解冻10分钟。将DNA与感受态细胞组合后，将溶液在冰上放置另外10分钟，然后置于42℃水浴中40秒以使细胞经受热休克，再次加入冰另外两分钟，混合用500μl无菌SOC培养基，并在旋转器上在37℃孵育1小时
将所得细菌转化体（50-100μl的SOC培养基中的细菌培养物）接种在合适的LB +药物（通常为氨苄青霉素或卡那霉素）平板（在37℃预热）中，并在37℃下孵育过夜。通常，每板100-500个单菌落生长。然后通过标准分子生物学方法分离来自几个代表性单个菌落的质粒DNA，并使用诊断PCR和DNA测序来测试，以确保组装的基因片段全部存在并且不具有任何突变或其他改变。这种整体的体内连接过程是非常强大和有效的，它通常仅需要分析1-2个菌落以获得所需的构建体（参见注释）。
避免陷阱的重要建议：在多年（十年）中对多种不同构建体（n> 1,000）的上述程序的应用表明，成功获得所需构建体的任何困难的最常见原因来自于序列杂交。我们已经发现，当观察到突变时，它们存在于基因之间的连接中片段，其直接对应于在初始PCR扩增中使用的引物序列。因此，确保初始寡核苷酸引物的高纯度/质量/均一性对于最大化该DNA装配方法的效率至关重要。

笔记

我们的系统包括与先前描述（Andersen，2011）的这种用于驱动酵母中的HR驱动的片段装配和质粒构建的一般方法的一些重要差异。

我们用于质粒制备的方法利用了含有选择性标记（营养缺陷型或耐药性盒）的PCR片段的掺入，其不同于可以位于使用的任何模板DNA上的任何模板DNA，或者其中构建体将被插入（图1B）。以这种方式，即使载体再循环，当选择用于分离携带所需构建体的克隆时，它不会产生任何假阳性。
当模板和载体不可避免地具有相同的选择标记时，在我们的程序中，通过用Dpn I限制性内切酶处理PCR反应产物，可以有效地消除假阳性，然后将它们掺入矢量
我们的方法在酵母质粒分离步骤中不使用苯酚：氯仿
使用 S的独特谱系。酿酒酵母菌株（基于SF838-1Dα）允许从酵母更有效的质粒拯救。
我们的方法允许在任何期望的序列的任何位置插入，无论它可以用于满足任何实验目标。这样的序列可以包括但不限于在蛋白质水平，内部表位标签，蛋白酶切割位点，蛋白识别结构域的适体，柔性接头和亚细胞定位信号，并且在核酸水平上包括限制性内切核酸酶切割位点，茎RNA结合蛋白的循环序列，loxP盒等。（图1C）。
我们的方法利用并强调体内的HR在单个组装步骤中产生复杂的多部分基因融合，结构域缺失或标记的构建体的能力。在我们的方法之前，这种方法只是作为一种手段简单克隆通过重组装大连续酵母基因组（Andersen，2011）。
通常，即使对于由5个或更多个单独的PCR片段（具有7-15kb的最终质粒大小）构建的质粒，仅需检查1-2个细菌克隆以获得感兴趣的构建体。总的来说，这里描述的体内连接和质粒回收的过程是用于精确产生复杂DNA组装体的有效的，成本有效的方法，并且当需要时可以以大规模并行的方式应用以产生数百个质粒构建体
最后，因为选择性标记物被掺入每个构建体中，所以其可以从包含它的载体扩增（或切除）并用于任何期望的受体生物体中的一步基因置换（Rothstein，1991），例如酵母KanR-标记的单倍体或二倍体基因组删除集合（Brachmann等人，1998）（图1D）。

图1.在酵母中通过同源重组在体内连接的复杂DNA装配。 A.说明在酵母中使用同源重组构建质粒的方案的工作流程图。 B.使用同源重叠引物尾（相同的颜色显示同源性，虚线说明跨越同源区段产生的重组事件）举例说明实施例构建体。基于EST的基于酵母的载体，例如基于LEU2的pRS315（Sikorski和Hieter，1989）。该图表示使用体内连接在一个步骤中装配成单个构建体的一系列基因片段的单个实例。对这种排列的修饰可以用于在单个基因内组装多个结构域，在N-或C-末端包括多个表位或荧光标签，和/或包括侧翼UTR序列，用于随后在非天然染色体上整合轨迹。 C.该实施例特别涉及该方法的有用性质。具体地，可以在待组装的两个相邻基因片段之间的同源重叠尾部中编码任何期望的非天然序列信息，以引入另外的目的序列（例如但不限于表位标签，富含Gly-Ser的接头序列，限制性酶切位点，蛋白质切割基序，信号序列等）。 D.构建后，整个构建体可以PCR扩增并在单个步骤中使用系统内设计的同源性（5'-和3'-UTR）整合到基因组中，或者在MX-4- Goldstein和McCusker（2001）设计的基于抗原的药物抗性盒系统，安装在每种类型的耐药性基因下游的共同序列（蓝色）之间的同源性，其中ADH1（t）是终止子来自 ADH1 基因座的序列。用修饰的感兴趣的基因替换基因缺失盒还允许在生长选择标记（药物抗性或营养物）中的交换。该系统也可以被修改以适应必需基因，只要受体细胞还含有表达来自第二质粒的WT必需基因的基于URA3基的载体，其可以随后通过反选择而消除在5-FOA培养基上（Boeke等人，1984）

食谱

1M山梨醇，0.1M Na 2 EDTA 调节至pH 7.5，过滤灭菌
YPD液体培养基
1％酵母提取物
2％蛋白胨
2％葡萄糖高压灭菌
SOB介质
2％胰蛋白酶
0.5％酵母提取物
10mM NaCl 2.5mM KCl
1mM MgCl 2
1mM MgSO 4
SOC介质
SOB介质
20mM葡萄糖终浓度
LB板（含适当药物）
15g/L琼脂 1％胰蛋白酶
0.5％酵母提取物
10g/L NaCl
4 mM NaOH

致谢

这项工作得到米勒研究基金会的支持，米勒研究所的基础研究在科学大学。加利福尼亚州伯克利（到G.C.F.）和NIH Research Grants GM21841（到J.T.）和GM101314（到Eva Nogales和J.T.）。该协议从Finnigan等人（2011）修改和修改。

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