材料和试剂

木薯植物，品种TMS60444（见注1）
菌株（在NYGA平板上生长48小时+抗生素选择）
MgCl 2
蛋白胨（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1420-500）
酵母提取物（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1422-500）
甘油
琼脂（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1423-500）
NYGA（见配方）

设备

28℃培养箱
5¾"玻璃一次性巴斯德吸管（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-678-20B），使尖端破碎并锉成平滑的直径为2mm的尖端（图3A）
2英寸×4英寸的覆盖有石蜡膜的纸板
Mini-Beadbeater-96（Biospec Products，目录号：1001）
3mm玻璃珠（Thermo Fisher Scientific，目录号：11-312A）
100×15mm培养皿
分光光度计（Pharmacia Biotech Ultrospec 3000）
约0.6厘米2 软木钻孔器
1.7ml Posi-Click管（Denville，目录号：C-2170）
单刃剃刀刀片（Garvey Products Inc.，目录号：40475）
1ml无针注射器（BD，目录号：309659）
用于测量发光的96孔板读数器（PerkinElmer，目录号：2104-0010）
96孔OptiPlate，黑色（PerkinElmer，目录号：6005270）
暗室，带胶片的X光成像暗盒，环形支架

1.7ml Posi-Click管（Denville，目录号：C-2170）

单刃剃刀刀片（Garvey Products Inc.，目录号：40475）

1ml无针注射器（BD，目录号：309659）

用于测量发光的96孔板读数器（PerkinElmer，目录号：2104-0010）

96孔OptiPlate，黑色（PerkinElmer，目录号：6005270）

暗室，带胶片的X光成像暗盒，环形支架

... EnVision microplate reader and the US LUM 96 default protocol before inoculation into cassava.

Grow transformed Xam colonies at 28 °C for 2 days on NYGA plates containing the appropriate antibiotics (Rifampicin 100 µg/ml, Tetracycline 10 µg/ml).
Resuspend Xam in 10 mM MgCl₂ at OD₆₀₀ = 0.6.
Add 100 µl to each well of a 96 well OptiPlate, including negative controls (10 mM MgCl₂ alone, untransformed Xam) as well as a positive control (E. coli with pLAFR-lux).
Run the US LUM 96 protocol and read the output for each well. Look for samples with values equal to or greater than the positive control.

Inoculations

Two days prior to the inoculation, streak out the Xam strains to be used from a glycerol stock onto NYGA plates containing the appropriate antibiotics and place at 28 °C for 2 days.
Prepare an inoculum from this plate by suspending the bacteria at OD₆₀₀ = 0.01 in 1 ml 10 mM MgCl₂ (see Note 2).
On the abaxial side of a leaf, create 2-3 close, shallow nicks with 剃刀刀片的尖端，避免主要静脉（图1A）
用一个 1ml无针注射器接种细菌悬浮液（OD 600 = 0.01）通过切口进入叶，总面积约为0.25 cm 2。用手指在自由手上，将叶片推向注射器同时渗透，施加足够的压力以鼓励接种物进入叶片（图1B）。或者，浸泡在Xam（pLAFR-emlux）接种物中的牙签可以用于通过直接穿刺接种叶通过midvein或apoplast，虽然结果可能变化更多比外质体浸润

图1.质外接种和样品处理 A.木薯叶具有由剃刀刀片制成的3个浅的下轴切口。 B.示范叶浸润使用无针注射器。 C.图片显示细菌悬浮液用无针注射器接种到叶外质体中。 D.显示用于生长的接种的叶外质体的取样面积的图测定接种后6天（dpi）

可视化

后在环境温度下生长5-6天，细菌可以是通过将叶子直接暴露于x射线胶片而可视化（图2）。为一个一次可视化，叶可以被移除并在标准中成像膜暗盒约1小时。用于继续跟踪细菌运动在同一片叶子，将植物放在黑暗的房间和使用粘合剂夹子夹住叶子和一片X射线胶片在两片之间的纸板。保持叶子升高使用环架与a 平台。 1小时后，取下夹子，拍摄影片，然后返回植物到其生长室完好以用于随后的成像

图2.通过a。可视化木薯中的xam 血管运动荧光素酶报道基因构建体接种到质外体中。 A. 注射器渗透的叶子（OD <600> = 0.01）的实例显示了Xam 条目进入附近的脉和进入中脉。 B.牙签接种叶（OD 600 = 0.01）。 C.通过牙签穿刺接种的病叶其 Xam 配置文件。信号丢失经常在现场观察到接种最可能是由于叶组织枯萎。（X =接种点; DPI =接种后天数）。

第二部分测定Xam 生长和症状发展

文化发展
在NYGA平板上生长 Xam 菌株，在28℃培养箱中抗生素选择40-48小时。
接种物的制备
1. 在约1ml的10mM MgCl 2中重悬平板细菌 OD 600 = 1.0。用10mM MgCl 2稀释至OD 600 = 0.2 叶中叶生长测定，OD 600 = 0.00005（首先OD 600 = 0.01，然后至最终OD）用于质外体生长测定，或OD 600 = 0.01用于质外体症状测定。
2. 选择和标记木薯叶接种（见注3）。叶子应该用一个标记来标明接种的细菌菌株，时间点和重复数（参见注释 4）。
联系

叶中叶生长测定
1. 把叶子放在一块石蜡膜覆盖的纸板上，近轴面朝上。
2. 将2mm直径的巴斯德移液管尖端浸入10mM MgCl 2中，然后使用它穿过一个清洁的洞穿过中间约4-5厘米从叶尖。确保10mM MgCl 2的膜保留在中以防止空气进入中间层，因为这将阻挡吸收的细菌悬浮液（图3A-B）。
3. 立即移液a 将5μl滴在孔上的OD 600 = 0.2细菌悬浮液（图3C）。移动到下一个接种点并重复。让滴干完全不受干扰。这可能需要30分钟。
4. 当所有接种完全和干燥时，开始组织提取第0天。
  
  图3.中脉生长测定接种和样品处理玻璃巴斯德吸管被修改，以使一个大约2毫米的孔叶中脉。 B.中膜接种点显示10mM的膜穿刺后的MgCl 2。 C.中滴定接种点用5μl滴细菌悬浮液。 D.在中期接种的木薯叶中间3个传单。包括接种点的0.6cm 2盘在第0天和第6天（虚线）。
叶质外质层生长和症状测定
1. 在叶的背面，创造2-3关闭，浅刻痕剃刀刀片的尖端，避免主要静脉（图1A）
2. 用一个 1ml无针注射器接种细菌悬浮液（OD 600 = 对于生长测定为0.00005，对于症状测定为OD 600 = 0.01）叶通过切口到约0.25cm 2的总面积。去做这个，用手指在自由的手上，推叶子靠着注射器同时渗透，施加足够的压力以鼓励接种物进入叶片（图1B）。
3. 对于症状测定，观察每个现场每天并跟踪水的外观和严重性浸泡症状，通常在接种后6天观察到（图4）。
  
  图4.代表 Xam 水浸症状的实例。 ++表示高水平水浸泡，+表示中等水浸泡，+/-表示少量或无水浸泡。
生长测定的组织提取

叶中叶生长测定（见注5）
1. 使用软木钻孔器，取大约0.6cm 2的圆叶冲头接种点恰好在中间（图3D）。放置在含有3mm玻璃珠和200μl10mM的Posi-Click管中冲孔 MgCl 2。
2. 使用珠磨机（2分钟，36 振荡/秒）。通过加入使每个样品达到1ml的体积 800μl10mM MgCl 2。
叶质外质层生长测定
1. 使用a 软木钻孔器，取大约0.6cm 2的圆叶冲头接种位点正好在中间（图1D）。将冲头放入 Posi-Click管，其含有3mm玻璃珠和200μl10mM MgCl 2。
2. 使用珠磨机（2分钟，36 振荡/秒）。通过加入使每个样品达到1ml的体积 800μl10mM MgCl 2。
稀释和电镀
1. 使串行稀释在10mM MgCl 2和10mM MgCl 2中的1ml粉碎组织样品板计数菌落形成单位（CFU）（图5A）
  
  图5。电镀和计数菌落形成单位（CFU）。 A.电镀图样品显示连续稀释。 B.图表显示代表性质外体生长测定的结果[以前在Cohn等人（2014）中发表]。
  
  叶中叶生长测定
  1. 接种点（第0天）：在微量离心管中制备1ml 10 -2和10μL稀释液（参见注6）。将这些稀释液的板级分进行最终稀释 10 ^-4，10 ^-5和10 ^-6（见注7）。
  2. 接种点（第6天）：在微量离心管中制备1ml 10 -4和10 -6 - 稀释。盘子这些稀释液的部分，以制备10μM，10μM，10μM和10μM的最终稀释物，和 10 ^-7（见注8）。
  叶质外质层生长测定
  1. 接种部位（第0天）：将100μl用于10 ^{-1稀释的粉碎的组织样品平板。}
  2. 接种位点（第6天）：制备1ml 10 -2个和10个稀释于<！ - SIPO -4 ，10 ^-5和10 ^-6的稀释液。
2. 将板置于28℃培养箱中4天
3. 计数菌落并校正稀释度。例如，5个殖民地 10 ^-6稀释板翻译成500,000 CFUs存在于原始样品。
4. 转化为每10份叶取样的log 10 CFU（图5B）。

笔记

植物应为2-3个月大。我们的植物通过插条繁殖（注9），并在没有人工照明，雾气（时间表：在上午6:00和下午6:00之间打开15分钟/15分钟）和平均温度27° C。
0.1的OD 600约为每ml约10 8个菌落形成单位（CFU）。
仔细选择叶片对减少技术变化非常重要。只有前2个完全展开的叶片应该使用。最好使用尺寸类似的传单。
我们通常每个时间点每个菌株进行6次重复。平均实验将在第0天和第6天测试6株，因此每个菌株有2个时间点和6个重复，使得72个接种点。
除了在接种点测定中脉生长外，还可以测量近端中脉部分的生长，尽管这种技术在技术上更具挑战性，并且叶选择变得非常重要，以减少样品变化（见注3）。为了测量近端中脉切片中的细菌生长，使用剃刀刀片在第6天时在包括接种点的叶冲头正上方切出3cm的叶中部。将中部切片置于含有3mm的Posi-Click管中玻璃珠和200μl10mM MgCl 2。使用珠磨机（2分钟，36振荡/秒）粉碎组织。通过加入800μl10mM MgCl 2使每个样品达到1ml的体积。在微量离心管中制备1ml 10 -2和10μL稀释液（见注6）。将这些稀释液的板级分制成10μM，10μM，10μM，10μM和10μMsup-6的最终稀释物（参见注释7）。 br />
例如，为了进行10μL稀释，将10μl粉碎的组织悬浮液加入990μl10mM MgCl 2溶液中。
例如，为了平板化10×10 -6稀释物，将10μL10×10 -4稀释物铺板在平板上并涂布;以铺板10 ^{-7稀释，将100μl的10 < - > -6稀释物铺在板上并铺开。}
这些稀释是指导，因为实际稀释将取决于正在测试的Xam 毒株的毒力。稀释应根据什么将允许您明确计数确定电镀后的菌落
为了通过插条繁殖植物，将所有叶子切离沿至少一半茎（6-12个月龄）木质化的植物。将茎切成部分，确保每个部分包括3-4个节点。将每个部分放入受精土壤中，注意保持茎部的上/下取向，并确保至少一个节点在土壤表面下方，并且至少一个节点在土壤表面上方。提供切割大量的水。新树叶应在大约一周后从顶层节点开始生长。

食谱

NYGA（1升）
5 g蛋白胨
3g酵母提取物
20ml 100％甘油
1.5克琼脂
1. 结合蛋白胨，酵母提取物和甘油，然后用水调至1 L，低热混合
2. 用1M NaOH将pH调至7.0
3. 在琼脂中混合。
4. 高压灭菌30分钟。

致谢

这项工作由NSF/BREAD（资助0965418，BJS），NSF研究生研究奖学金（MC，MS）和NIH遗传学培训资助2T32GM007127-36A1（MC）资助。 pLAFR- lux 载体由Sebastian Schornack通过Frank Thieme提供。感谢Rose Kantor帮助MS接种图1所示的接种物。中期生长测定方案改编自Castiblanco等人（2013）。

参考文献

Castiblanco，LF，Gil，J.，Rojas，A.，Osorio，D.，Gutierrez，S.，Munoz-Bodnar，A.，Perez-Quintero，AL，Koebnik，R.，Szurek，B.，Lopez，C 。，Restrepo，S.，Verdier，V。和Bernal，AJ（2013）。 TALE1从 Xanthomonas axonopodis pv。在植物细胞中作为转录激活子，并且对木薯植物的致病性是重要的。 Mol Plant Pathol 14（1）：84-95。 />
Cohn，M.，Bart，R.S.，Shybut，M.，Dahlbeck，D.，Gomez，M.，Morbitzer，R.，Hou，B.H.，Frommer，W.B.，Lahaye，T.and Staskawicz， Xanthomonas axonopodis 毒力是由转录激活子样效应物介导的在木薯中诱导SWEET糖转运蛋白。 Mol Plant Microbe Interact 27（11）：1186-1198。
Do Amaral，A.M.，Toledo，C.P.，Baptista，J.C.and Machado，M.A。（2005）。转型 Xanthomonas axonopodis pv。。 30：292-294。
Howeler，R.，Lutaladio，N.和Thomas，G。（2013）。节约与增长：Cassava：可持续生产集约化指南食品和农业联合国组织。
López，C. E.和Bernal，A. J.（2012年）。木薯细菌性枯萎病：使用基因组学来解释和管理一个老问题。/a> Trop Plant Biol 5（1）：117-126。
Lozano，J.C。（1986）。木薯细菌性枯萎病：一种可控的疾病。 Plant Dis 70：1089-1093。