材料和试剂

海砂（如 Merck，目录号：107711），以便于机械均质化样品
液氮
辣根过氧化物酶（HRP）（例如Sigma-Aldrich，目录号：P8375）
Urate氧化酶（UOX）（例如Sigma-Aldrich，目录号：U0880）
黄嘌呤氧化酶（XO）（例如，SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：38418）
Amplex超红（AR）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：A36006）
尿酸（例如Sigma-Aldrich，目录号：U2625）
黄嘌呤（例如Sigma-Aldrich，目录号：X7375）
二甲基亚砜（DMSO）（例如Sigma-Aldrich，目录号：D4540）
准备10 mM AR股票（见配方）
准备HRP，UOX和XO的库存（参见配方）

设备

标准平底微孔板（如 Greiner，目录号：655161）
用于读取多孔板的分光光度计（例如，ThermoScience MicroSkan Go），
带振动功能的加热块
超速离心机为20,000 x em （最好为40,000 x g ）
用于研磨样品的旋转器（例如 Heidolph RZR 2020，但更简单的装置也可以），具有组织研磨机，其整齐地配合到锥形锥形1.5ml管中（参见图1） >

图1.微管组织研磨机（Taylor Scientific）
精确分析天平，例如 Mettler Toledo XS系列，理想地配备了用于1.5 ml管的ErgoClip支架
加热磁力搅拌器
微量移液器（1,000,200,100,20μl）
多通道微量移液器（范围50-200μl）
1.5 ml反应管
0.5 ml反应管
15 ml管（如果需要稀释提取液）

程序

准备提取缓冲液和食谱中描述的种子（需要〜1小时）
测量前要准备的试剂和设备（〜1小时）
1. 准备500μM尿酸或500μM黄嘌呤的新鲜储备液用于标准曲线（参见图2，A行）。
  注意：
  1. 将尿酸或黄嘌呤加入〜200ml提取缓冲液（EB）中烧杯玻璃。开始加热并在加热板上搅拌（设定为〜100℃）。使用带温度计的pH计监测温度和pH。加热将有助于溶解化学品，但另外你会需要加入几滴1M NaOH（在视觉控制下这样做），直到所有尿酸或黄嘌呤溶解。一些碱化（你将达到约8.5-9）是必要的，因为两种化学品在水中溶解差。
  2. 新华（2006）描述了另一种制备尿酸储备液的方法，但是我们没有使用它。
2. 为每个植物样品生物学标记一组三个1.5ml管复制你想测量，你将需要一个试管提取（1号）和两次，收集每个样品的上清液提取（第2 + 3）。
收获植物样品
我们常规地分析各种植物部分，如发育种子（开花后7至19天龄），成熟干种子，幼苗（种子在琼脂平板上吸收后的3至15天龄），叶子在抽苔时间它们在莲座和根组织上的位置。更多细节参见Hauck等人（2014）中的图5。请注意，您需要包含野生型样品，以计算尿酸或黄嘌呤浓度的标准曲线。
对于每个样品，将空样品管（编号1）放置在电子天平的支架中，并将天平置回零，然后称重样品。根据经验，使用〜5-10mg种子，〜50-100mg叶子，〜20mg根。记下每个样品的重量。密闭样品管，将其转移到液氮中
提取程序（〜2小时）
1. 用组织研磨机设置旋转器，有EB和一瓶蒸馏水。
2. 为了避免任何遗留的代谢物，我们建议先匀浆野生型样品，其不含任何尿酸或黄嘌呤，除非你处理受胁迫植物的叶子
3. 拿一个样品从液氮中取出，小心打开盖子加入很多小海砂便于完全研磨和均匀化的样品。对100毫克叶添加500微升EB，5-10毫克种子加250 μlEB，然后开始研磨。更好地握住那些样品管！当样品呈现均匀时，关闭管的盖子并将其转移回到液氮。用蒸馏水彻底冲洗雌蕊水并继续下一个样品
4. 设置加热块（插图必须适用于锥形1.5毫升锥形管）至95℃。将所有样品转移回室温，小心打开盖子，等待几分钟，关闭盖子，将所有管转移到95°C 热块。
5. 打开盖一次，以避免突然弹出可能导致样品损失。随后在95℃下热摇动10分钟在室温下以20,000×g离心15分钟。
6. 用微量移液管小心转移上清液至第二套管（2号），每个样品重复如下：再次加入如前所述EB的量，涡旋，热摇动和离心如前，转移上清液到管（编号2）。
7. 最后，超声波离心所有管（2号），理想地在40,000×g下离心15分钟。以彻底沉淀组织碎片并转移所有上清液最后到第三套新鲜管（3号）注意：作为尿酸或黄嘌呤在A.t.中的种子发育期间积累。 uox或xdh1 突变体，使用15ml管进行稀释（例如2x，5x）的最终测量干燥种子时提取物（管3号）。
  最初时测量代谢物标准，我们发现之间存在线性关系在560nm的吸收和尿酸或黄嘌呤的浓度 250μM。
准备50微升的标准品和样品（〜30分钟，每板）
对于尿酸（或黄嘌呤）标准，使用相同植物部分的野生型提取物，如您正在测量的样品，因为这将基本消除由颜料引起的可能偏差。野生型提取物通常不会最后，超声波离心所有管（2号），理想地在40,000×g下离心15分钟。以彻底沉淀组织碎片并转移所有上清液最后到第三套新鲜管（3号）注意：作为尿酸或黄嘌呤在A.t.中的种子发育期间积累。 uox或xdh1 突变体，使用15ml管进行稀释（例如2x，5x）的最终测量干燥种子时提取物（管3号）。
最初时测量代谢物标准，我们发现之间存在线性关系在560nm的吸收和尿酸或黄嘌呤的浓度 250μM。

准备50微升的标准品和样品（〜30分钟，每板）
对于尿酸（或黄嘌呤）标准，使用相同植物部分的野生型提取物，如您正在测量的样品，因为这将基本消除由颜料引起的可能偏差。野生型提取物通常不会... 10
20
30
35
40
45
50
55
60
Working solution (WS) consists of:
Amplex
red (AR), µl
5
10
15
17.5
20
22.5
25
27.5
30
HRP，μl
2
4
6
7
8
9
10
11
12
UOX
（或XO），微孔
4
（2
8
4
12
6
14
7
16
8
18
9
20
10
22
11
24
12）
提取
缓冲区（EB），ml
0.5
1.0
1.5
1.75
2.0
2.25
2.5
2.75
3.0

表1将帮助您准备工作解决方案。
例如要测量图2所示的平板，您将需要（2×4 + 16×2）×50μl= 40×50μl= 2.0ml（更好地制备2.5ml）工作溶液与UOX（或XO），和16×2×50μl= 1.6ml（制备2.0ml）不含UOX（或XO）的工作溶液。保护受光保护的WS（例如包裹铝箔）。

设置96孔微量滴定板

图2.设置为在四至六个生物重复中测定不同年龄（Rows BG）的叶中尿酸含量的96孔板的设置实施例，每个重复一次（柱1/2，3/4 ，5/6 等）。上述设置提供了EXCEL表中显示的数据。

尿酸标准品一式两份（A1-4，A7-10）：A行含有不同 50μl野生型提取物中的尿酸浓度+50μl 工作解决方案（WS）与UOX
样品：柱1-6含有50 μl样品提取物+50μlWS与UOX，7-12列含有50μl样品提取+50μlWS，无UOX。

设置扫描仪和读取板（〜20分钟/板）

在通过添加WS开始反应之前，请确保您可以访问光度计下15-20分钟。尽快读出可能在开始反应之后（通过添加WS），因为O 2和光将偏向您的测定（见摘要）
将光度计设置为560nm处的吸光度，并以1-2分钟间隔读出，以便您可以以图形方式跟踪反应。
理想情况下使用多通道移液器添加50 ul WS与UOX（或XO）到左侧孔和标准品，或50μlWS没有UOX（或 XO）到右侧井。左侧的每个井然后包含50 μMAR，20毫单位HRP和20毫单位UOX（或2毫单位XO） 100μl。右侧孔将含有50μMAR和20毫单位HRP 只有。
瞄准在移液而不引入气泡井。通过用干燥的移液管尖端刺破移除气泡针，然后将板插入光度计并读出板反复直到反应终点大约15-20后 min。达到，由达到平台的吸光度指示。

计算样品的尿酸/黄嘌呤含量
将读数复制粘贴到提供的EXCEL-Sheet，然后执行计算的步骤I1-5。
注意：参考图2，使板的读数与EXCEL-Sheet的相应列匹配。

从具有/不具有UOX或XO的重复中，对于每个样本计算吸收值的算术平均值M sub W和W sub WO。
然后减去M w，反应2（无UOX/XO）从M w的吸收值，反应1（与UOX/XO的吸收）的吸收值。 > 请注意，此操作也会消除由背景引起的y轴偏移。
从尿酸或黄嘌呤标准品计算回归线的斜率S [in 1 /μM]。
对于每个单独的测定，代谢物浓度为C sub （M -M ）/S [以μM为单位]（假定没有稀释）。
考虑到提取体积V sub [以μl计]代谢物的量给定的样品是N sub = C subA x V sub [以mol计]。其含量为P mg 样品和因此该样品的代谢物浓度 C sub = P sub/P [μmol/g]。
我们定期提供EXCEL表使用：行30-39显示光度计的典型吸收读数 11-20分钟。行39包含20分钟后的平台值，并且是只有用于后续计算的光度数据。细胞用橙色填充突出显示计算步骤I1-5。对于我们我们进一步区分鲜重，fw，从干重，dw （我们在加热箱中在60℃下保持参考样品2天）样品并添加新鲜假样品中含有的水分（fw-dw）到提取体积（见列L）。

代表数据

所提供的EXCEL表包含图2所示的板设置的读出。通过将自己的读出数据粘贴到行39中来使用它。

笔记

该方案是在几个月的过程中发展的，并且发现在单次测定中可靠地测量高达250μM的尿酸和黄嘌呤浓度，因为这是吸收和代谢物浓度之间的线性关系的范围（参见EXCEL表）。当测定在相应的酶突变体中大量累积代谢物的干燥种子时，可能需要在装载孔之前在15-ml管中进行3或5倍稀释。

食谱

准备10 mM AR股票
加入400微升DMSO至购买的AR的1毫克小瓶，充分混合，并存储为50微升等分试样在-20°C。
一个小瓶足以容纳800个孔（= 800个单反应）
准备HRP，UOX和XO的库存
从0.5M Tris/HCl pH 7.5缓冲液储液制备〜500ml的0.1M提取缓冲液
然后使用提取缓冲液制备
库存 100单位/ml HRP
50单位/ml UOX
10单位/ml XO
从所购买的酶制剂（试剂4-6），并将其以50μl等分试样在-20℃下储存。使用的等分试样可以在4℃下储存数周。

致谢

这项研究由德意志Forschungsgemeinschaft（格兰特DFG WI3411/1 2）和德国学术交流服务从德国联邦教育和研究部，计划德中研究组资助。

参考文献

Hauck，O.K.，Scharnberg，J.，Escobar，N.M.，Wanner，G.，Giavalisco，P.and Witte，C.P。（2014）。拟南芥中的尿酸积累尿酸氧化酶突变体通过阻断而损害幼苗建立过氧化物酶体维持。植物细胞 26（7）：3090-3100
生命技术： https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp22181.pdf。
生命技术： https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp22182.pdf。
新华，D.尿酸标准储备液的制备临床化学2006; v。52，p.2117-2118
来源图1： http：//www .taylorscientific.com/taylorscientific /一次性 - PELLET-PESTLES-with-Microtubes-Kimble-Chase-P13260.aspx