新华，D.尿酸标准储备液的制备临床化学2006; v。52，p.2117-2118

来源图1： http：//www .taylorscientific.com/taylorscientific /一次性 - PELLET-PESTLES-with-Microtubes-Kimble-Chase-P13260.aspx

... Vermiculite 1-4 mm (Agrena Rungis, catalog number: VERMOYS100)

Carborundum 0.037 mm (used as an abrasive) (VWR, catalog number: 22540.298)

Recombinant BPMV RNA1 plasmid (pBPMV-IA-R1M) (Zhang et al., 2010) (Note 1)

Recombinant BPMV RNA2 plasmid (pBPMV-IA-V1, as a BPMV wild-type control) (Zhang et al., 2010) (Note 1)

Recombinant BPMV RNA2 plasmid (pBPMV-GFP2) (green fluorescence protein) [as a gene expression positive control (Zhang et al., 2010) (Note 1)]

Recombinant BPMV RNA2 plasmid, (pBPMV-PvPDS391bp) (phytoene desaturase) [as a VIGS positive control (Pflieger et al., 2014) (Note 1)]

Miracloth (Calbiochem^®, catalog number: 475855-1R)

K₂HPO₄ (Sigma-Aldrich, catalog number: P3786)

KH₂PO₄ (Sigma-Aldrich, catalog number: P0662)

MilliQ water

Absorbant paper 1500F (Argos, catalog number: 106)

Liquid nitrogen

Qiagen kit "Plasmid Maxi Kit" (QIAGEN, catalog number: 12163)

肥料厂 - 产品14-12-32（Puteaux SA）

Fertilil Fertiligo L（Fertil International SA）

营养解决方案（参见配方）

0.1 M磷酸钾缓冲液（见配方）

50 mM磷酸钾缓冲液（见配方）

设备

植物生长的温室或生长室
植物病理学试验的温室或生长室（注2）
Pipetmans（Gilson，型号：p1000，p200，p100，p20和p10）和提示
-20°C冰箱
-80°C冰箱
涡流
塑料盆（7×7×6cm盆和20cm直径盆4L）
生长室
乳胶手套
外科口罩
微量离心机
Eppendorf微量离心管
1.5 ml微量离心管
砂浆（直径9cm）和研杵（12mm直径）
用于GFP检测的UV灯（高强度100瓦长波UV灯，UVP ）
UV面罩（Thermo Fisher Scientific，目录号：6355）

程序

通过直接DNA摩擦初级接种的普通豆"黑色情人节"植物的生长
1. 在装满湿蛭石的塑料盆（7×7×6cm）中播种普通豆"黑情人"（注3）种子。小心将种子放在蛭石表面下。
2. 将花盆放入装有自来水的桶中，并置于23℃，16小时光照/8小时黑暗循环和75％相对湿度的生长室中（注4）。
3. 通过定期用自来水向盆中灌水来浇灌幼苗，以便通过毛细管作用（大约每两天，在我们手中）进行浇灌。
4. 让幼苗在10-12天（初级叶完全膨胀的阶段）生长。
5. 在这个发育阶段，植物准备接种（图1A）。如果您需要在接种后保持植物超过两周，我们建议在20厘米直径的盆中，在潮湿的蛭石中移植三棵幼苗。将锅放在盛满水的托盘上。
6. 将植物放置在19°C和75％相对湿度的黑暗的房间中24小时，然后接种（注4）。
通过直接DNA摩擦BPMV衍生的感染性质粒来机械接种BPMV载体
1. 使用BPMV衍生的感染性质粒机械接种普通豆，为每个BPMV构建体提供12个黑色情人节植物。
2. 为了接种一株植物，在Eppendorf微量离心管（注释5）中将5μgpBPMV-IA-R1M与5μgpBPMV-IA-V1在终体积为20μl的50mM磷酸钾缓冲液pH 7中混合。
3. 为了接种一株植物，在Eppendorf微量离心管（注释5）中，在终体积为20μl的50mM磷酸钾缓冲液pH 7中，将5μgpBPMV-IA-R1M与5μgpBPMV-GFP2或基因表达构建体质粒DNA混合。
4. 为了接种一株植物，在Eppendorf微量离心管（注释5）中，在终体积为20μl的50mM磷酸钾缓冲液pH 7中，将5μgpBPMV-IA-R1M与5μgpBPMV-PvPDS391bp或VIGS构建体质粒DNA混合。 br />
5. 在微量离心机中短暂涡旋并旋转管
6. 用金刚砂粉刷每棵植物的一片主叶的上表面（程序参见视频1）。粉尘的金刚砂的大致量应如视频1和图1B所示。不要粉尘太多的碳化硅，因为它可以在摩擦后产生不良的坏死区域。
  
  视频1.在Phaseolus vulgaris中的BPMV初级接种（步骤B6）
7. 使用移液管，将20μlDNA质粒混合物放置在叶柄和叶片之间的连接处的叶上表面（图1C）。
8. 使用戴手套的手指（视频2）使DNA质粒快速扩散遍及叶子表面。
  
  视频2.PMP中的BPMV初级接种。 vulgaris （步骤B8-9）
9. 用戴手套的手指穿过6次来擦拭叶片表面。使此顺序进行两次（视频2）。所有叶面应擦拭。小心不要过于用力。
10. 在摩擦后约3-4分钟，用洗瓶中的自来水冲洗接种的叶子，直到所有的金刚砂被去除（图1D）。
11. 使用吸收纸轻轻地除去叶子上部的过量的水（图1E）。当叶片变弱时，小心不要撕裂叶片（图1F）。
  
  图1.通过直接DNA摩擦BPMV衍生的感染性质粒进行的机械接种 A.在10-12天的"黑色情人"的完全扩展的初级叶。 B.一棵主要叶每植物用金刚砂粉化。 C.将20μlDNA质粒混合物放在叶柄和叶片之间的接合处的叶上表面上。如图1所示，用戴手套的手指在整个叶子表面上扩散DNA质粒液滴。D.用包含在洗瓶中的自来水充分冲洗接种的叶子。 E.用吸水纸浸泡过量的水。 F.干燥的接种初生叶
12. 将接种的植物放在温室或生长室中，在19℃，16小时光照/8小时黑暗循环和75％相对湿度下（注4）。
13. 在机械接种后，通过将营养溶液直接倒入锅碟（在20cm直径的碟中约500ml）来施肥植物。以3-4天的间隔施肥。
14. BPMV-Wt诱导的病毒症状在接种后约3至4周发生在变成斑驳和膨胀的上部系统叶上（图2A）。使用BPMV-Wt载体的成功感染率为92-100％（Pflieger等人，2014）。
15. 在紫外光下接种后约9天和接种后17天后，在上部系统叶上（在Pflieger中）可以在初生叶上观察到BPMV-GFP（= pBPMV-IA-R1M + pBPMV-GFP2） et al。，2014，见图1）。使用BPMV-GFP载体的成功感染率为55％（Pflieger等人，2014）。
16. 对于初次接种的植物，不总是观察到对应于由BPMV-PvPDS391bp（= pBPMV-IA-R1M + pBPMV-PvPDS391bp）诱导的PDS基因沉默的白色漂白表型（图2B）。使用BPMV-PvPDS391bp载体的成功感染率为58-91％（Pflieger等人，2014）。
17. 对于每个BPMV构建体，在接种后3至4周收获系统感染的小叶。优选选择幼嫩的上叶。将一个小叶放在铝纸中，并将样品冷冻在液氮中
18. 将所有小叶样品存储在-80℃，直到用于机械接种感染的叶组织（=二次接种）。
  
  图2.在 P中获得的代表性症状。 vulgaris cv。通过对BPMV衍生的感染性质粒进行直接DNA摩擦来机械接种BPMV载体后的'Black Valentine'植物。 A.BPMV-Wt，接种后4周。 B.BPMV-PvPDS391bp，接种后3,5周。
使用感染的叶组织机械接种BPMV载体的常见豆类植物的生长（=二次接种）
1. 遵循A（注6）中所述的相同协议。
2. 当分析除"黑色情人"之外的其他豆类基因型时，10-12天的生长持续时间可以延迟，直到达到初级叶的完全扩展阶段。
使用感染的叶组织机械接种BPMV载体
1. 将新鲜的或冻结的感染的普通豆"黑色情人节"的传单放在砂浆中（图3A）
2. 用杵短暂地研磨该组织以获得绿色醪液（图3B）
3. 加入约3-4ml pH7,50mM磷酸钾缓冲液以制备叶汁
4. 再次用研杵研磨以获得绿叶汁液（图3C）。由于叶汁通常是异质的，让它沉淀几分钟。
5. 粉末每个植物的一个主叶的上表面与金刚砂（视频1和图1A）。不要粉尘太多的碳化硅，因为它可以在摩擦后产生不良的坏死区域（注7）。
6. 剪切一张约8 x 6厘米的Miracloth片（图3D），并将其折叠成四片（图3E）。
7. 将折叠的Miracloth浸泡在叶汁中（图3F）。
  
  图3.使用感染的叶组织机械接种BPMV载体。 A-C。通过用研钵和研杵研磨感染的叶子来制备受感染的叶汁。 D-E。 Miracloth部分折叠四。 F.将折叠的Miracloth片浸泡在叶汁中。
8. 与浸泡的Miracloth快速摩擦整个叶面（视频3）。
  
  视频3. BPMV二次接种in。 vulgaris
9. 通过与折叠的Miracloth（视频3）6通过摩擦叶表面。使此顺序进度只有一次。所有叶面应擦拭。
10. 在摩擦后约3-4分钟，用洗瓶中的自来水冲洗接种的叶子，直到所有的金刚砂被去除（图1D）。
11. 使用吸水纸除去多余的水（图1E）。
12. 将接种的植物放置在19℃，16小时光照/8小时黑暗循环和75％相对湿度的生长室或温室中。
13. 在机械接种后，通过将营养溶液直接倒入锅碟（在20cm直径的碟中约500ml）来施肥植物。以3-4天的间隔施肥。
14. 根据测试的基因型，在接种后约2至4周，在上部系统叶上发生由BPMV-Wt诱导的病毒症状（在Pflieger等人，2014，参见图3） />
15. 在接种后约4至9天，在UV光下和在接种后10至17天后，在上部系统上可以在初级叶上观察到BPMV-GFP（= pBPMV-IA-R1M + pBPMV-GFP2）叶子（在Pflieger等人，2014年，见图1）。
16. 通常在接种后3至4周观察到对应于由BPMV-PvPDS391bp（= pBPMV-IA-R1M + pBPMV-PvPDS391bp）诱导的PDS基因沉默的白色漂白表型（在Pflieger等人， 2014，见图6），一般在幼嫩的上叶
17. 对于所有BPMV载体，二次接种的成功感染率接近100％（Pflieger等人，2014）。

笔记

源自BPMV RNA1或BPMV RNA2的所有重组质粒由重组大肠杆菌菌株携带，并使用Qiagen试剂盒"Plasmid Maxi Kit"根据供应商的说明书将质粒制备为浓缩的"大量制备物"。为了构建含有感兴趣的外源片段的新的BPMV载体，参考Zhang等人（2013）中的详细方案。
请记住，BPMV是一种病毒性病原体，其操作必须符合您的国家立法关于生物安全关注和遏制以排除不受控制的病毒传播。
我们建议使用common bean cv。用于通过直接DNA摩擦进行机械接种的"黑色情人节"，因为该基因型对BPMV高度敏感，因此产生高度浓缩的接种物用于任何其他基因型的二次接种。
<绿豆>种子萌发和生长在23℃是最佳的。病毒感染和沉默诱导在19℃更好。因此，在接种前24小时，一旦接种，将植物放置在19℃的生长室中
pBPMV-IA-R1M与pBPMV-IA-V1的接种产生BPMV-Wt载体，其应在所有实验中用作阴性对照。 pBPMV-IA-R1M与pBPMV-GFP2的接种产生BPMV-GFP载体，其应当在基因表达实验中用作阳性对照。 pBPMV-IA-R1M与pBPMV-PvPDS391bp的接种产生BPMV-PDS载体，其应在VIGS实验中用作阳性对照。
对于使用感染的叶组织的二次接种，常见的豆类基因型的选择可能取决于您的研究目标。请记住，使用BPMV载体进行基因表达或VIGS需要普通豆基因型对BPMV敏感。你可以通过接种你感兴趣的基因型与BPMV-GFP载体进行测试。然而，在我们的工作中，我们显示在一些易感豆基因型（例如 JaloEEP558）中，GFP荧光仅在接种的原生叶中可见，但病毒载体不移动到上部未接种的叶因此在这些叶子中没有观察到GFP荧光（Pflieger等人，2014）。
对于二次接种，不要用金刚砂粉末所有植物。用米拉摩擦20片叶子后，它会浸泡叶汁和金刚砂。由于过量的金刚砂摩擦后会产生不需要的坏死区域，我们建议不要用金刚砂或真正轻微地除去其他植物。

食谱

营养溶液
肥料厂 - 产品14-12-32（终浓度= 0.28kg/L）肥料Fertiligo L（终浓度= 4.35ml/L）自来水
0.1M磷酸钾缓冲液（pH7）
制备KH 2 PO 4 1M的溶液：27.2g在200ml MilliQ水中的溶液
制备K 2 HPO 4 1M的溶液：34.8g在200ml MilliQ水中的溶液
将38.5ml的KH 2 PO 4 NH 4 M与61.5ml的K 2 HPO 4 M 1 br /> 用pH试纸控制pH值
应为pH 7
50mM磷酸钾缓冲液（pH7） 25ml 0.1M磷酸钾缓冲液（pH7） 25 ml MilliQ水

致谢

通过修改用于拟南芥中的TYMV接种的程序（Pflieger等人，2008）和BPMV（Pflieger等人，2008）来开发并优化

参考文献

Diaz-Camino，C.，Annamalai，P.，Sanchez，F.，Kachroo，A.and Ghabrial，S.A。（2011）。一种有效的基于病毒的基因沉默方法，用于在普通豆中进行功能性基因组学研究。 em>植物方法 7：16.
Pflieger，S.，Richard，M.M.，Blanchet，S.，Meziadi，C.and Geffroy，V.（2013）。 VIGS技术：用于豆科植物功能基因组学研究的有吸引力的工具。 Func Plant Biolog 40（12）：1234-1248。
Pflieger，S.，Blanchet，S.，Camborde，L.，Drugeon，G.，Rousseau，A.，Noizet，M.，Planchais，S.and Jupin，I。（2008）。使用"一步法"在拟南芥中高效的病毒诱导的基因沉默 'TYMV-derived vector。 Plant J 56（4）：678-690。
Pflieger，S.，Blanchet，S.，Meziadi，C.，Richard，M.M.，Thareau，V.，Mary，F.，Mazoyer，C.and Geffroy，V.（2014）。 "一步"的豆荚斑驳病毒（BPMV） - 衍生的载体是用于有效过表达异源蛋白，病毒诱导的基因沉默和在普通豆中的BPMV R基因的遗传作图的功能基因组工具（ > BMC Plant Biol 14：232.
Zhang，C.，Bradshaw，J.D.，Whitham，S.A.and Hill，J.H。（2010）。开发有效的多用途豆荚斑驳病毒病毒载体外源基因表达和RNA沉默。植物生理学 153（1）：52-65。
Zhang，C.，Whitham，S.A。和Hill，J.H。（2013）。大豆和普通豆中的病毒诱导基因沉默方法 975：149-156。