材料和试剂

细胞和质粒
1. TRF2-HEK293T细胞：用TRF2表达载体稳定转染的293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
2. 对照-HEK-293T细胞：293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）其已经用空的对照载体稳定转染
3. Myc-REST4表达载体：通过修饰Myc-REST质粒产生（Huang et al。，2011），如在Ovando-Roche等人（2014）中详述的。
4. HA-泛素表达载体：（Addgene，目录号：17608）
抗体
1. 抗TRF2抗体（EMD Millipore，目录号：05-521）
2. 抗HA抗体（Sigma-Aldrich，目录号：H6908）
3. 抗β-肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A5441）
4. C-Myc抗体（Santa Cruz，目录号：SC-40）
5. 山羊抗小鼠轻链特异性（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：115-035-174）
6. 小鼠抗兔轻链特异性（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：211-032-171）
7. 正常小鼠IgG（Santa Cruz，目录号：SC-2025）
试剂
1. Dulbeccos改良的Eagle培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D5671）
2. 胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）
3. 磷酸钙转染试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：CAPHOS）
4. 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
5. 溴酚蓝（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0404）
6. CaCl ₂ （VWR International，目录号：22317.297）
7. Dynabeads蛋白G（Life Technologies，目录号：10003D）
8. EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：ED-1KG）
9. EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E4378）
10. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
11. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
12. KCl（VWR International，目录号：JT3040-1）
13. MG132（Calbiochem，目录号：474791）
14. MgCl <2> （Sigma-Aldrich，目录号：63063）
15. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：s-3014）
16. NaOH（VWR International，目录号：28244.263）
17. Nonidet P40（VWR International，目录号：E109-100ML）
18. 苯基甲磺酰氟（Sigma-Aldrich，目录号：93482）
19. 蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
20. SDS（Sigma-Aldrich，目录号：71725）
21. Tris-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T3253）
22. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
23. 吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
24. 泛素醛（Boston Biochem，目录号：U-201）
缓冲区
1. 抗体结合缓冲液（参见配方）
2. HEPES裂解缓冲液（见配方）
3. 2x电泳样品缓冲液（见配方）

设备

100mm细胞培养皿（Corning，目录号：430167）
细胞刮刀（Corning，目录号：3010）
1.5ml Eppendorf管（StarLab，目录号：S1615-5500）
BD Microlance 3 21G针（BD，目录号：301156）
37℃，5％CO 2强制空气培养箱（Binder，型号：C150）中。
微量离心机（Hettich，型号：200R）
热固性混合机（Eppendorf，型号：5350）
旋转器（Stuart，型号：SB3）
Dynamag 2磁体（Life Technologies，目录号：12321D）

程序

培养物TRF2-HEK293T和对照细胞在具有标准培养基（含有10％FBS的DMEM）的100mm皿中。达到60-70％融合后，使用磷酸钙转染试剂盒按照制造商的说明书用质粒Myc-REST4/HA-泛素共转染细胞。
转染后48小时，用标准培养基中的20μMMG132（防止光照）处理细胞，并在37℃，5％CO 2下孵育5小时。
除去培养基并用PBS洗涤细胞，然后在600毫升冷冻的HEPES裂解缓冲液（在冰上/4℃孵育4分钟，然后刮，以提高蛋白质产量）在100毫米的培养皿中溶解细胞。
收集细胞裂解液在Eppendorf管中，并通过21G针的裂解液〜25次，以帮助裂解和切碎DNA。
向裂解物中加入泛素醛至终浓度为1μM，并在旋转器上以20rpm在4℃下混合样品15分钟。
在4℃下将样品以12,000xg离心15分钟以沉淀细胞碎片，并将上清液转移到新管中。
使用50μl蛋白G Dynabeads在4℃下用旋转器以20rpm预清洁样品1小时以除去非特异性粘附于珠粒的蛋白质。
将抗体结合到珠上用于免疫沉淀（IP）：
2. 每次IP反应分配50μl珠子
3. 放在磁铁上以从溶液中分离珠子，吸出溶液
4. 在500μl结合缓冲液中稀释3μgMyc抗体，并对正常小鼠IgG对照进行相同操作。
  注意：由于Myc抗体来自小鼠，正常小鼠IgG用作阴性对照。
5. 通过在室温下孵育30分钟和在4℃下振荡孵育30分钟，将抗体结合至珠。
量化预先清除的样品的蛋白质浓度，并准备1毫克蛋白每IP和每个输入20微克蛋白质
在抗体珠结合后，将含有珠的管置于磁体上并除去结合溶液。用结合溶液洗涤珠一次，以除去任何过量的抗体
将1mg预先纯化的蛋白质转移到已经连接Myc抗体或正常小鼠IgG的珠中。混合样品，并在4℃下以20rpm旋转孵育2小时以进行IP。
在形成珠 - 抗体 - 抗原复合物后，将样品放回到磁体上以除去上清液。
重悬在400μl裂解缓冲液中的珠子，并放回磁铁，如上所述除去上清液。
重复步骤13两次以洗涤任何非特异性结合的珠子
最终洗涤后，将珠子 - 抗体 - 抗原复合物在100μl裂解缓冲液中重悬，并转移到干净的管中
将样品放在磁铁中，取出上清液。重悬在40μl2X电泳缓冲液中的复杂沉淀，剧烈涡旋和在微量离心机中的脉冲旋转收集所有的溶液到管的底部。
将上述样品在70℃下在热混合器中摇动加热10分钟
将样品放回磁体最后一次，并将上清液转移到新管（IP管）
在95℃下煮沸IP样品和输入样品（每个样品直接从步骤9得到20μg裂解物）5分钟。
通过蛋白质印迹分析样品。
1. IP的具体性和质量：为了验证的功能 TRF2对REST4的泛素化，有必要保证类似在表达TRF2之间沉淀Myc-REST4蛋白的量和对照细胞，并且该沉淀是特异性的。因此，IP 用抗c-Myc（1：1,000）抗体测试样品，如图所示图1.
2. TRF2对REST4泛素化的影响：IP样品是还测试了与抗HA的泛素结合（1:1000稀释）抗体作为泛素用HA表位标记。
3. 保证正确的蛋白表达和加载，所有细胞裂解物无用抗c-Myc测试免疫沉淀（输入样品）（1：1,000），抗-TRF2（1:500）和抗β-肌动蛋白（1:5,000）抗体。

代表数据

这是一个代表性的结果，显示在与Myc-REST4和HA标记的泛素（HA-Ub）共转染的细胞中清楚地检测到REST4的泛素化，并且TRF2的表达减少了这些细胞中REST4的泛素化。结果表明TRF2通过抑制其泛素 - 蛋白酶体降解来稳定REST4表达（Ovando-Roche等人，2014）。

图1.TRF2抑制人REST4泛素化。将对照和TRF2稳定过表达的HEK293T细胞与Myc-REST4和HA-泛素（HA-Ub）表达载体共转染。将Myc免疫沉淀（IP）或全细胞裂解物（输入）用所示抗体免疫印迹。免疫印迹是两次独立实验的代表。

食谱

抗体结合缓冲液
PBS + 0.01％吐温20（1μl吐温20至10ml PBS）
HEPES裂解缓冲液
20mM HEPES（pH7.4） 10 mM KCl
100mM NaCl sub 2
1mM MgCl 2
1mM EDTA
0.1 mM EGTA
0.5mM CaCl 2·h/v 在使用前，加入下列试剂至指定的最终浓度：1×蛋白酶抑制剂混合物，0.2mM苯基甲磺酰氟，0.1％Triton X-100和0.5％Nonidet P40
2x电泳样品缓冲液
2.5ml 0.5M Tris-HCl（pH 6.8）
2ml甘油 4ml 10％SDS（w/v） 0.94ml dH 2 O 2 / 0.16ml 1.25％溴酚蓝
总体积：9.5 ml
准备1毫升，加入50微升巯基乙醇到950微升2×样品缓冲液

致谢

我们感谢Lerner研究所的Shideng Bao博士的REST质粒。这项工作得到了BBSRC，MRC（G0802537）和Genesis研究信托基金的资助。这项工作改编自以前发表的作品（Ovando-Roche等人，2014年）。

参考文献

Bhattacharyya，S.，Yu，H.，Mim，C.and Matouschek，A。（2014）。受调节的蛋白质周转：蛋白酶体活动的快照。 Nat Rev Mol Cell Biol 15（2）：122-133
Huang，Z.，Wu，Q.，Guryanova，O.A。，Cheng，L.，Shou，W.，Rich，J.N。和Bao，S。 Deubiquitylase HAUSP稳定REST并促进维护的神经祖细胞。 Nat Cell Biol。 13：142-152
Ovando-Roche，P.，Yu，J.S.，Testori，S.，Ho，C.and Cui，W.（2014）。 TRF2介导的hREST4的稳定化对于神经祖细胞的分化和维持至关重要。干细胞 32（8）：2111-2122。
Ristic，G.，Tsou，W.L.and Todi，S.V。（2014）。神经系统中的最佳泛素 - 蛋白酶体途径：去泛素化酶的作用。前面的Mol Neurosci 7：72.
Weissman，A.M.，Shabek，N。和Ciechanover，A。（2011）。掠食者成为猎物：通过泛素化和降解来调节泛素系统。 Nat Rev Mol Cell Biol 12（9）：605-620