材料和试剂

动物
C57bl/6J小鼠（Charles River Laboratories），在PND4-5
出生日定义为PND1
PND 5只幼仔的体重应为2.0±0.2 g
美学
1. 异氟醚（Vetflurane，目录号：137317）
2. Xylocain（局部麻醉剂）（AstraZeneca，目录号：153270）

设备

缝合
6-0丝缝合针连接到皮肤闭合针（Vömel，目录号：14719）
7-0丝缝合切成1.0cm-1.5cm用于动脉结扎（Ethicon，Johnson& Johnson，目录号：EH7464G）
皮肤缝合针
微孔手术胶带（Sollentuna，目录号：1530-0,3M）
注射器，1ml（B.Braun，Omnifix 100 Solo）
加热板（Labotect，型号：Hot plate 062）
镊子（图1）：
用于解剖动脉的细尖弯曲钳（Dumont，镊子样式7，目录号：0302-7-CO）
用于解剖动脉的细尖直钳（Nopa instruments，目录号：AB 501/05）
用于提升动脉的钩形钳（Dimeda Instrumente GmbH，目录号：42.883.07）
细尖剪刀（锋利）（Dimeda Instrumente GmbH，目录号：08.340.09）
用于给予麻醉气体的鼻罩（Simtec Engineering，目录号：10025）
麻醉蒸发器（Ohmeda Isotec Isoflurane Vaporizer）
手术显微镜（Carl Zeiss，型号：S100/OPMI pico）
水温可调（格兰特，型号：W14）
缺氧室，温度受控，加湿气流和可变氧水平（图2）
注意：在该方案中，使用Dräger运输培养箱5400和Gant型W14水浴（图2A）将环境温度保持在36℃。将较小的定制培养箱（缺氧室）保持在运输培养箱内（图2B）。在缺氧程序期间将小狗放置在缺氧室内。将空气和10％氧气引入定制培养箱的底部，并从培养箱的顶部排出。在被引入缺氧室之前，将空气和10％氧气的混合物加湿，并用热水浴加热至36℃。定制的缺氧室直径为19cm，长度为19cm（图2C）。

图1.手术工具。用于抬起动脉（A），细尖的直镊子（B）和弯曲的钳子（C）用于解剖动脉的钩状细尖镊子，以及细尖的用于皮肤切口的剪刀（D）。

图2.用于缺氧治疗的设备 A.含有缺氧外倾的水浴和运输孵化器。 B.运输培养箱内的缺氧室，和（C）定制的缺氧室的尺寸

图3.缺氧 - 缺血程序时间线

程序

注意：缺氧的持续时间，室温度，以及小鼠的年龄和品系都是对脑损伤结果具有显着影响的因素。在这个模型中，我们使用70分钟的缺氧（图3）。然而，这种缺氧时间可能需要根据每个实验室的独特条件经验调整

手术

准备/备注
1. 设置手术区。
2. 在通风处工作（图4）。
3. 在手术前称每只小狗。
4. 确保使用加热板保持小狗温暖手术前后。尽量减少手术时间，避免冷却的小狗 - 这对于程序的结果非常重要！除此之外，不需要额外关注动物护理。如果使用正常的C57bl/6J幼仔，手术应在清洁下进行，但是不一定无菌，条件。但是，这可能需要根据所使用的小鼠的应变进行调整。
5. 放置小狗在一个小的干净的纸盒有一个薄的底部允许良好的接触之间的箱子和加热板，以确保热量可以进行到位于箱子底部的幼仔。
用于保持瞳孔温暖的加热板（左，B），用于麻醉的鼻罩（中心，C）和麻醉蒸发器（右，D）。

过程
1. 使用鼻罩（5.0％用于诱导和1.5％至3.0％用于维护）用异氟烷麻醉小鼠。
2. 使用微孔手术胶带轻轻固定小狗的背部（图5A）。保持鼻罩与异氟烷的位置。
3. 用剪刀打开皮肤，在靠近中线的颈部做一个0.2厘米-0.3厘米的切口（图5B）。
  
  图 5.手术和动脉结扎 A.用鼻罩固定的小狗麻醉。中线用黑色实线表示切口由黑色虚线表示，并且顶部胸骨由黑色箭头指示。动脉表示为箭头1和静脉由箭头2指示。D.切开的动脉是由钩状钳子举起。 E.在动脉下的缝线如箭头1所示，并且没有缝合线的静脉由箭头2. F.结扎的动脉。 G.缝合伤口。 H.申请的Xylloc在伤口上
4. 使用细尖镊子小心推开脂肪和肌肉。相近中线会有一个口袋下面的脂肪和肌肉，和这是左颈总动脉将位于的位置。
5. 非常接近颈总动脉将是一条静脉。确保不要混淆动脉和静脉（图5C）。
6. 静脉比动脉更为表面，动脉比静脉更内侧（向左）。
7. 与静脉相比，动脉更红，并且将具有明显的脉搏。
8. 使用细尖镊子仔细解剖动脉静脉，迷走神经和其他周围软组织。
9. 什么时候动脉已经解剖，使用弯曲的细尖镊子或钩镊子隔离和提起动脉（图5D）。
10. 有了另一只手，拿起准备好的1 cm-1.5 cm长的7-0缝线直或弯钳。抓住缝合线的一端与弯曲或钩状镊子抱住动脉，轻轻拉动缝合线动脉（图5E）。
11. 通过用缝合线制造两个结来缝合动脉（图5F）。
12. 用6-0缝线闭合伤口。做两个结（图5G）。
13. 用局部麻醉剂通过加入一滴渗透伤口使用1ml注射器将Xyllocin涂到伤口上（图5H）。
14. 放小狗回到加热板上并允许小狗从中恢复麻醉。小狗已经恢复，当他们醒了，开始再次移动。
15. 当所有的小狗都经过手术，所有的小狗回到他们的大坝休息1小时。
缺氧

准备/备注
1. 腔室中的温度应严格保持在36℃。重要的是，这个温度不会改变，因为幼仔不能保持其体温。 1-2°C下降温度（低体温）可以导致减少的脑损伤，和增加的温度可导致增加的脑损伤。
2. 为了将室温严格保持在36℃，空气和10％氧气必须在流过室之前被加热和加湿。
3. 气流和通过室的10％氧气流量均为4L/min。
4. 在我们实验室的正常情况下，缺氧缺血治疗导致小于10％的死亡率。实验者需要注意增加死亡率，可能是指示问题设备或程序。
过程
1. 在将幼仔放入腔室之前5分钟开始加热和加湿的空气流过腔室。
2. 小狗从手术中恢复了1小时，他们的大坝，放小室中并且保持通过室的气流 10分钟。
3. 在10分钟的气流之后，将气流从空气变为10％氧气（通过混合空气和氮气）70分钟。
4. 在10％氧气孵育期间定期检查温度，以确保温度稳定在36°C。
5. 在10％氧气中70分钟后，将流量从10％氧气改变为空气10分钟。
6. 在空气中10分钟后，从小室里的小狗，并返回他们的大坝。

代表数据

图6。代表数据。硫素/酸性品红染色的脑冠状切片的代表性显微照片显示3天同侧半球（右侧）的损伤程度在PND5的HI后70分钟的缺氧。箭头表示局部皮质下白质损伤和小鼠大脑同侧半球的海马损失。

笔记

HI应该在大坝活动较少的白天进行。这使得更可能的是，水坝停留在巢中，以保持小狗在手术后/HI返回时温暖。否则，幼崽可能遭受低温，这将影响脑损伤程度，并有助于结果的变化。

致谢

该协议改编自先前发表的Albertsson等人的研究（2014）。 XW和AM研究由瑞典医学研究委员会（VR 2008-2286和VR 2013-2475至XW），比尔& Melinda Gates基金会大挑战探索与全球健康（OPP1036135至XW），瑞典政府资助给公共卫生服务研究人员（ALFGBG-367051和ALFGBG-367051至XW），VINNMER-Marie Curie国际资格（VINNOVA，2011-03458至XW），Wilhelm和Martina Lundgren（37/2013至XW和vet2-26/2013至AM）。

参考文献

Albertsson，AM，Bi，D.，Duan，L.，Zhang，X.，Leavenworth，JW，Qiao，L.，Zhu，C.，Cardell，S.，Cantor，H.，Hagberg， C.和Wang，X。（2014）。早产性脑损伤小鼠模型缺氧缺血后的免疫反应。 em> J Neuroinflammation 11（1）：153
Hedtjarn，M.，Leverin，A.L.，Eriksson，K.，Blomgren，K.，Mallard，C。和Hagberg，H。（2002）。白细胞介素-18参与缺氧缺血性脑损伤 J Neurosci 22（14）：5910-5919。
Rice，J.E.，3rd，Vannucci，R.C。和Brierley，J.B。（1981）。不成熟对大鼠缺氧缺血性脑损伤的影响 Ann Neurol 9（2）：131-141。
Sheldon，R.A.，Sedik，C.and Ferriero，D.M。（1998）。在缺氧缺血的新生小鼠中的应变相关的脑损伤。脑Res 810（1-2）：114-122。
Vannucci，R.C.，Connor，J.R.，Mauger，D.T.，Palmer，C.，Smith，M.B.，Towfighi，J。和Vannucci，S.J。（1999）。围产期缺氧缺血性脑损伤的大鼠模型 J Neurosci Res 55（2）：158-163。
Vannucci，S.J.and Hagberg，H。（2004）。未成熟大脑中的缺氧缺血 J Exp Biol 207（Pt 18）：3149-3154。
Zhu，C.，Wang，X。和Blomgren，K。（2009）。脑缺氧 - 新生大鼠或小鼠中的缺血：围产期脑损伤的模型，在急性神经损伤的动物模型中。参见：Chen，J.et al。（eds）。 Humana Press，221-230。