材料和试剂

Huh7.5细胞（Charles Rice lab，Rockefeller University）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM高葡萄糖）（HyClone，目录号：SH30243.02）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10437-028）
抗生素抗真菌溶液（10,000U/ml青霉素G，10,000μg/ml链霉素，25μg/ml两性霉素B）（HyClone，目录号：SV30079.01）
MEM非必需氨基酸（NEAA）（Corning Incorporated，目录号：25025CI）

材料和试剂

Huh7.5细胞（Charles Rice lab，Rockefeller University）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM高葡萄糖）（HyClone，目录号：SH30243.02）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10437-028）
抗生素抗真菌溶液（10,000U/ml青霉素G，10,000μg/ml链霉素，25μg/ml两性霉素B）（HyClone，目录号：SV30079.01）
MEM非必需氨基酸（NEAA）（Corning Incorporated，目录号：25025CI）
QuickExtract DNA Extraction Solution (Epicentre, catalog number: QE09050)
Platinum PCR SuperMix High Fidelity (Life Technologies, Invitrogen^TM, catalog number: 12532016)
Primers flanking the TALEN target site (custom DNA nucleotides) (Integrated DNA Technologies)
QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, catalog number: 28704)
Tris-HCl buffer (pH 6.8, 0.5 M) (Bio-Rad Laboratories, AbD Serotec^®, catalog number: 1610799)
Sodium dodecyl sulfate (20% solution) (Thermo Fisher Scientific, catalog number: BP13111)
甘油（Fisher Scientific，目录号：BP2291）
溴酚蓝（Thermo Fisher Scientific，目录号：B3925）
2-巯基乙醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：O3446I100）
10％DMEM培养基（参见配方）
20％DMEM培养基（参见配方）
FACS缓冲区（参见配方）
2x SDS加样缓冲液（见配方）

设备

在37℃和5％CO 2/s的细胞培养箱中培养
细胞培养处理的聚苯乙烯板（100mm，6孔，12孔，24孔，48孔，96孔）（康宁公司）
聚苯乙烯圆底管（5ml FACS管）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352008）
圆底管帽（5ml）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352032）
40微米细胞过滤器（Falcon ，目录号：352340）
荧光显微镜
台式离心机
FACSAria细胞分选仪（BD Biosciences，目录号：656700）
多通道移液器
Western印迹设备（Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec ）
热块（VWR国际）
PCR热循环仪（Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec ）
琼脂糖凝胶电泳系统
3730 DNA分析仪（Life Technologies，Applied Biosystems ，目录号：3730S）

程序

将TALEN和EGFP质粒共转染到Huh7.5细胞中
1. 板Huh7.5细胞在100毫米细胞培养板上在15毫升10％DMEM 培养基中不含抗生素18-24 h，转染前使用在转染时细胞将〜60-70％汇合。规模根据制造商的方案对培养物进行上下培养使用的细胞类型。
2. 结合8μg的右TALEN，8μg的左TALEN和8μgEGFP质粒在1.5ml Opti-MEM培养基中。混合轻轻地。准备控制单独的管，如模拟转染，其控制转染试剂的潜在副作用（仅包括在步骤A中）。
3. 在单独的管中，加入60μl Lipofectamine 2000至1.5ml Opti-MEM培养基。轻轻混合并在室温下孵育5分钟
4. 加入DNA-Opti-MEM 溶液（来自步骤A2）至Lipofectamine-Opti-MEM溶液步骤A3）。通过轻轻地吸取上下溶液彻底混合溶液。在室温下孵育20分钟。
5. 加入1.5 ml的 DNA-脂质复合物到细胞中，轻轻地摇动平板并均匀分布复合物。
6. （可选）〜6 h后，更换新鲜的10％DMEM培养基的培养基。
7. 在37℃下用5％CO 2孵育细胞48小时。
8. 通过使用荧光显微镜测量GFP阳性细胞的数量，近似转染效率
使用荧光激活细胞分选（FACS）富集GFP阳性细胞
1. 转染后48小时，用1x PBS洗涤细胞，然后胰蛋白酶化细胞并向上和向下移液以强力打碎细胞聚集体
2. 加入10％DMEM培养基以灭活胰蛋白酶。
3. 在200×g离心细胞10分钟。
4. 吸出上清液，并在FACS缓冲液中重悬细胞沉淀 Recipes），浓度为10×10 6个细胞/ml。移液器上下移动彻底获得单细胞悬浮液。
5. 放置单元格过滤器通过FACS管（在乙醇中灭菌）和小心吸取细胞通过过滤器进入管中以除去细胞团块。细胞应立即分类或放在冰上覆盖，直到准备好
6. 使用FACSAria细胞分选仪将GFP阳性细胞分选到20％DMEM培养基中。
7. 细胞活力通常在转染后减少排序。因此，分选的细胞应该在相当高的细胞接种密度在新鲜的20％DMEM培养基中，并允许恢复〜1 周。在此恢复时间内每3-4天更换一次介质。
注意：如果单元格无法恢复，请从更大的单元格编号开始重复实验。
通过在96孔板上连续稀释产生单细胞克隆
1. 一旦细胞已恢复，添加100微升20％DMEM培养基到96孔板的第一个孔，除了A1。
2. 悬浮分选的细胞，浓度为1×10 4个细胞/ml。
3. 加入200微升的分选细胞悬液到孔A1，然后转移100微升到井B1，依此类推，直到第一列中的所有井都包含细胞。从H1中弃去100μl，然后向孔中加入100μl培养基 A1-H1，最终体积为200μl。
4. 使用多通道移液器，从第一列转移100微升到第二列和对所有列重复。使所有孔的最终体积为200μl
5. &在37℃下用20％DMEM培养基中的5％CO 2孵育细胞。分析每天井标记那些包含单个细胞。关监测和严格性是获得这一步骤的关键单细胞克隆。
6. 允许单细胞克隆汇合在96孔板中，然后轻轻地胰蛋白酶消化并转移至48孔板。重复这个过程，使细胞缓慢扩展到更大的表面积以促进细胞生长（例如从96孔转移）至48孔至24孔至12孔至6孔板）。
通过蛋白质印迹分析蛋白质表达以鉴定具有基因敲除的单细胞克隆
1. 在12孔板中，用1×PBS洗涤细胞，然后收集细胞胰蛋白酶消化。加入10％DMEM培养基以灭活胰蛋白酶
2. 以200×g离心细胞10分钟。
3. 吸出上清液并用2x SDS上样缓冲液（见Recipes）裂解细胞以提取蛋白质
4. 立即使用热板在100℃下煮沸样品10分钟，然后以最大速度离心1分钟。样品可以储存在-20°C。
5. 通过蛋白质印迹分析蛋白质表达（图1A）
通过DNA序列分析确认基因敲除
1. 使用QuickExtract DNA溶液根据制造商的协议提取DNA。
2. 用位于TALEN靶位点侧翼的基因组引物进行PCR。
3. 通过凝胶电泳分析PCR产物
4. 使用Qiagen凝胶提取试剂盒根据制造商的方案分离和纯化DNA
5. 序列DNA以确认导致基因表达丢失的TALEN诱导的indel的存在（图1B）。

代表数据

图1。代表性数据。 A.用于鉴定CIDEB蛋白表达阴性的4个克隆的代表性Western印迹，表明TALEN基因敲除。 B.克隆3的代表性DNA序列分析，证实靶区域含有导致基因表达丧失的TALEN诱导的缺口。

笔记

对于步骤B，Huh7.5细胞显示低转染效率（〜10-15％）;因此，FACS是富集GFP +细胞的重要步骤。然而，对于具有高转染效率的细胞系如293T，HeLa和RKO细胞，分选可能不是必需的。如果通过荧光显微镜和/或流式细胞术确定转染效率超过80％，则来自步骤A的转染细胞可以直接用于步骤C中的单细胞克隆。
存在用于单细胞克隆的各种方案，包括通过连续稀释（如本文所述），通过克隆环，并通过直接计数并以0.5细胞/孔接种细胞。最佳方法将由所使用的细胞系和基因敲除后细胞的存活力确定。
根据可用的设备和筛选的大小，可以更容易地首先在DNA水平分析克隆，然后通过Western印迹确认阳性克隆。这是由实验者自行决定。

食谱

10％DMEM培养基
补充有10％FBS，1×NEAA，100U/ml青霉素G，100μg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素B的DMEM
20％DMEM培养基
补充有20％FBS，1×NEAA，100U/ml青霉素G，100μg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素B的DMEM
FACS缓冲区
含5％FBS的PBS
2x SDS凝胶上样缓冲液
含有4％十二烷基硫酸钠（SDS），20％甘油，0.2％溴酚蓝和10％β-巯基乙醇的0.1M Tris-HCl（pH6.8）

致谢

这项工作是由NIH授权R01 A1079150支持。

参考文献

Wu，X.，Lee，E. M.，Hammack，C.，Robotham，J. M.，Basu，M.，Lang，J.，Brinton，M.A。和Tang，H。细胞死亡诱导性DFFA样效应物b是丙型肝炎病毒进入肝细胞所必需的。 a> J Virol 88（15）：8433-8444。