材料和试剂

单体延伸蛋白从不同植物细胞悬浮培养基中提取。关于详细的延伸提取方案，参见Lamport等人（2011b）。
牛血清白蛋白（BSA，冻干粉，结晶，纯度≥98.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：05470）
乙酸钠（NaOAc，无水，纯度≥99.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：S8750）
乙酸（HOAc，ACS试剂，纯度≥99.7％）（Sigma-Aldrich，目录号：320099）
去离子蒸馏水（ddH 2 O）

材料和试剂

单体延伸蛋白从不同植物细胞悬浮培养基中提取。关于详细的延伸提取方案，参见Lamport等人（2011b）。
牛血清白蛋白（BSA，冻干粉，结晶，纯度≥98.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：05470）
乙酸钠（NaOAc，无水，纯度≥99.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：S8750）
乙酸（HOAc，ACS试剂，纯度≥99.7％）（Sigma-Aldrich，目录号：320099）
去离子蒸馏水（ddH 2 O）
Kimwipes (VWR International, catalog number: 470173498)
Plastic petri dishes (100 x 15 mm dimension) (VWR International, catalog number: 25384302)
NCS18 silicon probe (75 kHz, 3.5 N/m) (Mikromasch, catalog number: HQ:NSC18/Cr-Au-15)
Scotch tape (single sided Scotch^® Magic^TMTape 810)
Note: Available from office supply stores like Staples.
10 ml sterile syringes (BD Biosciences, catalog number: 309659)
0.2 µm syringe filters (Whatman, catalog number: 6896-2502)
20 ml disposable scintillation glass vials (VWR International, catalog number: 66022065)
Eppendorf tubes(1.5 ml) (Eppendorf, catalog number: 022431081)
Regular microscope slides (dimension 25 x 75 x 1mm)
MFP-3D-SA AFM (Asylum Research, model: MFP-3D-SA AFM)
Stainless steel tweezers (Sigma-Aldrich, catalog number: T5415)
Cylinder of nitrogen gas with a pressure regulator and nozzle
涡流搅拌器
离心机（以配合Eppendorf 1.5ml管）

软件

IGOR Pro 6（WaveMetrics，Portland，OR）

程序

成像前准备
1. 缓冲液准备
  1. 在使用前将ddH 2 O通过0.2μm注射器过滤器过滤到干净的玻璃小瓶中
  2. 制备50mM NaOAc缓冲液（pH 5.2）。在使用前，通过0.2μm注射器过滤器将缓冲液过滤到干净的玻璃小瓶中。
2. 准备蛋白储备液
  溶解蛋白质样品至1mg/ml的浓度，过滤缓冲液作为储备溶液，使用1.5ml Eppendorf Protein LoBind Tube （见注1）。将储备溶液分成100μl部分（见注释 2）。使用前将储备液等分试样储存在-20°C
3. 成像"基板"的准备（见注3）
  用ddH 2 O洗涤一个载玻片，然后用75％乙醇冲洗。空气干燥载玻片，并将Loctite ^®环氧速溶混合胶水涂抹幻灯片的中心。在快速混合两种胶组分后，使用镊子小心地从其盒中移除HOPG并将其放置顶部的胶水。允许过夜孵育的紧密结合 HOPG到幻灯片。
AFM成像的样品准备
1. 准备稀释的蛋白质样品
  稀释蛋白储备到所需浓度（参见注释4）与相应的缓冲液或ddH 2 O使用 Eppendorf Protein LoBind Tubes（见注1），轻轻混合稀释液涡旋，然后将蛋白质溶液以3000×g离心2分钟 min。
2. 基材准备
  HOPG有多层，每层层是原子平坦的。每天进行一次AFM实验层。要获得一个新的HOPG层，只需使用苏格兰磁带粘附到先前的表面并剥离旧表面。注意有时需要多次尝试以实现视觉上平坦的HOPG 表面（见注5）。
3. 蛋白结合HOPG
  后获得新鲜的HOPG表面，将带有HOPG的载玻片放在a中培养皿和沉积100微升的蛋白质溶液到中心 HOPG表面。用盖子盖住培养皿，以防止不必要污染从周围环境。放置潮湿Kimwipes 如果培养时间长，培养皿（避免与HOPG直接接触）（大于30分钟）以减少样品蒸发。
  允许将蛋白质溶液在HOPG上孵育1分钟或更长时间注6）。孵育后，使用Kimwipes（见注7）吸去蛋白质溶液并冲洗HOPG表面与100μlddH 2 O。刮除剩余的液体并干燥表面进一步在N 2气流的缓慢蒸汽下2分钟。在这一点上，样品制备完成，HOPG表面准备用于AFM 扫描。
延伸素自组装的AFM成像
请参阅用户手册（ http://mmrc.caltech.edu/Asylum） /Asylum%20MRP-3D%20manual.pdf ），来自Asylum Research的MFP-3D SA AFM的操作。使用"AC模式"（手册第6章，第121-142页）在空气中扫描样品。我们使用的探针是来自Mikromasch的NCS18硅探针（参见材料和试剂）。为了更好的分辨率，推荐使用Hi'Res-C14探头（目录号：Hi'Res-C14/Cr-Au-5），因为它们的尖端半径更小（〜1 nm）。探头安装后，光学检测激光对准和探头调谐，在主面板上（参见手册中的第136页），选择初始扫描参数如下：
扫描尺寸= 5.00μm
扫描速率= 0.75 Hz（见注8）
扫描点数/行数= 256
设置点= 800.00 mV
积分增益= 4（见注9）
通过降低AFM头并开始扫描，将AFM探头接合到样品表面。请注意，主面板上的"驱动幅度/频率"值是在探头调整完成后仪器自动填充的值，因此不需要更改这些值。
扫描开始后，首先让系统扫描2分钟，以稳定探针，并调整仪器以适应周围环境的振动。然后手动降低"设置点"值，直到表面要素开始显示在高度图像上。通过调整"设置点"和"积分增益"值可以实现成像优化。最后，对于每个图像中的更多像素，"扫描点"和"扫描线"可以增加到512或甚至1,024（见注10），从而提高图像质量。
对于自组装图案的确定，对于每个样品在HOPG表面上的五个不同位置取至少五个图像。
图像处理
在进行任何测量之前，需要使用IGOR Pro软件中的"平展"功能对图像进行平整。可以使用IGOR Pro软件在图像上直接测量分子的高度（即直径）和长度的信息。图像的默认颜色设置为灰色，但IGOR Pro具有各种内置颜色方案，可用于之后对图像进行假彩色。同时，也可以调整每个图像的对比度和亮度以更好地呈现图像

代表数据

图1.拉伸自组装的图像。（a）来自番茄悬浮培养（TOMP1）的单体延伸蛋白前体1。（b）Extensin类似物YK8。（c）Extensin类似物FK9。（d）BSA用作对照。 YK8和FK9是分别在其蛋白质序列中含有8个重复的SOOOOSOSOOOOYYYK和9个重复的SOOOOSOSOOOOFFFK的伸展蛋白类似物，并且从培养物中的烟草BY2细胞中纯化（Held等人，2004）。单字母氨基酸代码：酪氨酸（Y），赖氨酸（K），苯丙氨酸（F），丝氨酸（S），羟脯氨酸（O）。所有蛋白质在pH 5.2 NaOAc缓冲液中以10μg/ml成像，沉积1分钟。白色比例尺：500nm。 TOMP1和伸展蛋白类似物都显示与来自拟南芥的EXTENSIN 3相似的头对尾树突自组装（Cannon等人，2008），而BSA显示没有这样的组装但仅显示蛋白质聚集。图像（d）中的红色箭头表示分散的单球形BSA分子

图2.在pH 5.2 NaOAc缓冲液中TOMP1的浓缩和沉积时间依赖性自组装。 TOMP1在5μg/ml的HOPG上10分钟沉积后显示头对尾树突自组装。 b。在更高浓度（10μg/ml）TOMP1在相同的时间段组装成多孔网络，表明自组装的程度是浓度依赖性的。 C。当10μg/ml的TOMP1沉积1分钟时，观察到类似的（a）中TOMP1的装配，用白色圆圈突出显示，表明TOMP1自组装的程度也遵循时间依赖性方式。 TOMP1自组装的测量的实例：（1）由图像（c）中的圆圈中的白色条突出的平均链段长度为78.2±4.2nm，这与之前的TOMP1多肽长度的电子显微镜测量一致约79nm（Heckman等人，1988）。该观察结果表明在每个区段中出现一个TOMP1分子。（2）由图像（c）中的红色条突出显示的平均单分子高度为2.7±0.2nm。该值对应于单个TOMP1分子的直径。（3）图像（c）中由绿色圆圈突出显示的三个分子的连接点的平均高度为5.2±0.2nm。该值表明TOMP1分子形成横向和重叠结合达两个分子深。白色比例尺：500nm

笔记

库存和成像中使用的蛋白质浓度相对较低。使用Eppendorf蛋白LoBind管将防止蛋白质与管的非特异性结合，从而导致实验中使用更准确的蛋白质量。
重复冻融将导致蛋白质降解和意想不到的聚集。每个实验使用一个等分试样，以帮助防止这种蛋白原料的损害
在AFM成像中，其上沉积样品溶液的表面称为"基板"。我们使用HOPG蛋白质的成像，由于其疏水性，允许蛋白质与表面的稳定结合。为了研究其它壁组分，例如壁多糖和细胞壁本身，可以使用其它底物如云母（用于多糖）或带电载玻片（用于细胞壁）作为替代物，以确保样品与底物表面的结合。 br />
根据实验的目的，可以使用各种蛋白质浓度。从我们的经验，低蛋白浓度（5或10微克/毫升）将有利于观察拉伸单分子组装，而较高的浓度（50微克/毫升）将导致有序形成的网络。
HOPG在多次使用后将变薄，因此使得逐渐更难以获得新的视觉上平坦的表面。根据其原始高度尺寸（1 mm），当HOPG高度小于0.4 mm时，建议更换。
类似于注释4，孵育时间的长度也决定了观察到的自组装的模式。通常在更长的温育后，观察到形成良好的延伸蛋白网络。从我们的经验，延伸素分子附着到HOPG表面发生很快。孵育时间短至1分钟就足以结合延伸素与HOPG
不推荐使用普通纸巾，因为可能有意想不到的纤维或碎片可能污染样品表面。
首先使用慢速扫描速率保护探头，"扫描速度"会在选择"扫描速率"时自动设置。
在开始使用低"积分增益"保护探头。此值可以在以后的扫描中提高以获得更好的图像质量。
"扫描点"和"扫描线"确定每行上的像素点数和在图像中扫描的行数，在大多数情况下，这两个值应保持不变。

食谱

50mM NaOAc缓冲液 0.41g NaOAc
100ml蒸馏水
用HOAc调节pH至5.2
75％乙醇向75ml 100％乙醇中加入25ml水，制成100ml 75％乙醇

致谢

该方案采用来自Cannon等人（2008）的修改。这项工作的资金来自国家科学基金会（＃IOS955569到M.J.K和IOS0955805到M.C.C）。

参考文献

Cannon，M.C.，Terneus，K.，Hall，Q.，Tan，L.，Wang，Y.，Wegenhart，B.L.，Chen，L.，Lamport，D.T.，Chen，Y.and Kieliszewski，植物细胞壁的自组装需要一个延伸蛋白支架。 Proc Natl Acad Sci USA 105（6）：2226-2231。
Hall，Q.and Cannon，M.C。（2002）。细胞壁富含羟脯氨酸的糖蛋白RSH对于拟南芥中的正常胚胎发育是必需的。植物细胞 14（5）：1161-1172。
Heckman，J.W.，Terhune，B.T.and Lamport，D.T。（1988）。通过电子显微镜和凝胶过滤表征天然和修饰的延伸蛋白单体和寡聚物。 em> Plant Physiol 86（3）：848-856。
Held，M.A.，Tan，L.，Kamyab，A.，Hare，M.，Shpak，E。和Kieliszewski，M.J。（2004）。二 - 异酪氨酸是交联的富含异酪氨酸的延伸蛋白类似物的分子间交联in vitro 。 J Biol Chem 279（53）：55474-55482。
Lamport，D.T.，Kieliszewski，M.J.，Chen，Y.and Cannon，M.C。（2011a）。延伸超家族在原代细胞壁结构中的作用植物生理学 156（1）：11-19。
Lamport，D.T.，Tan，L。和Kieliszewski，M.J。（2011b）。原代细胞壁的结构蛋白：提取，纯化和分析。 Methods Mol Biol 715：209-219
Smith，J.J.，Muldoon，E.P。和Lamport，D.T.A。（1984）。通过直接洗脱完整的番茄细胞悬浮培养物来分离外显子前体。 Phytochem 23，1233-1239
Smith，J.J.，Muldoon，E.P.，Willard，J.J。等人（1986）。番茄延伸蛋白前体P1和P2是高度周期性结构。 Phytochem 5 ，1021-1030。