材料和试剂

成年雌性Sprague-Dawley大鼠（175-200g）
EMJH培养基（按照补充数据中所述制备）
牛血清白蛋白（BSA）
EMJH + BSA（10mg/ml BSA，BSA浓度20mg/ml）（Millipore，目录号：810037）
注意：用于培养钩端螺旋体的白蛋白的质量是至关重要的。请验证用于DMC植入的白蛋白支持标准体外生长条件下毒性钩端螺旋体的生长。测试其他来源的BSA（例如，Millipore，目录号：840644和Sigma-Aldrich，目录号：A-9647）。
在标准体外条件（28-30 ° C）（Zuerner，2005）
超纯水（去离子，蒸馏）（例如，Milli-Q）
1mM EDTA（pH8.0）
将再生纤维素透析膜管（Spectrum Laboratories，目录号：132655）（频谱分析/目录号：132655） >
过滤单元（0.22μm，250ml，无菌）（例如，Millipore Stericup 过滤单元）
氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉鸡尾酒（40-80mg/kg/5-10mg/kg，肌肉内给药）
眼用软膏（例如，Puralube）
Betadine ^®手术擦洗溶液
卡洛芬（5-10mg/kg，皮下给药）
乙醇（70％）
氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉鸡尾酒（见配方）
EMJH + BSA培养基（参见配方）

设备

手术手套（单独包装，无菌）
一次性血清移液管（10ml无菌，单独包装）
手术巾（切成12英寸（46厘米）的方块，无菌）
纱布（4×4无菌）
配备有暗场聚光镜（例如Olympus，型号：BX40）的显微镜
三个2-L Pyrex烧杯（每个包含磁力搅拌棒）
带搅拌选项的热板
超长钝端钳（无菌）
吸管填充物（，例如，Drummond Scientific，型号：Pipet-Aid）
手术器械包，每只动物一只，使用前灭菌，并保存在无菌包装内：
刮刀（第10号）
手术刀架
剪刀，虹膜，4英寸（〜10.2厘米）
组织钳，5½英寸（〜14厘米）（1x 2齿解剖或Adson-Brown）
组织钳，5 1/2英寸（〜14厘米）（钝端）
带有内置剪刀（例如，Olsen Hegar）的针夹钳（5½英寸）
（〜14cm）
缝合，Ethicon 40，SH 1，27（〜68.6厘米）涂布Vicryl，紫色编织缝线
Autoclip ^® 9毫米不锈钢伤口闭合夹和施药器
生物安全柜（生物安全2级，型号：BSL2）
循环温水毯和泵
电动毛发/毛发剪刀
玻璃珠灭菌器（例如，Braintree Scientific，型号：Germinator 500）（可选）

程序

无菌透析膜管的制备
1. 按照以下步骤填充三个2升Pyrex烧杯：
  烧杯1：1 - 1.5 L超纯水
  烧杯2：1-1.5L 1mM EDTA（pH 8.0）
  烧杯3：1 - 1.5 L超纯水
2. 向每个烧杯中加入磁力搅拌棒，盖上重型铝箔和高压釜。
  注意：为了确保无菌性，应在手术当天对烧杯进行高压灭菌。
3. 将每个烧杯放在热板上，在恒定搅拌下使其沸腾。
4. 戴无菌手套，将透析膜管切成条7-9 英寸（〜18-23cm）长度使用无菌剪刀。每切一条动物加1-2额外。
5. 轻轻地系住管道的一端通过在DMC的顶部形成环而形成简单的反手结使管的自由端通过环。修剪掉多余的使用无菌剪刀从绑扎端取出管子
6. 放置绑管插入烧杯1并更换铝箔盖。务必保持箔盖足够宽以允许蒸汽逸出。煮沸管 20分钟。不断搅拌。
  注意：油管应始终保持浸没。
7. 使用无菌超长镊子，传输管到烧杯2.更换铝箔盖和煮沸管20分钟。持续搅拌。
8. 使用烧杯3重复步骤A7。
9. 一旦冷却到触摸，转移烧杯3到生物安全机柜（BSC）。为了确保无菌，含有管的烧杯应保留在BSC中。
注意：透析膜管可以提前几天制备并在4℃下储存。煮沸后，使用无菌钝头镊子将透析膜管传送到0.22μmStericup过滤单元（Millipore）的底部。在约100-200 ml的Ultrapure-Q水中更换过滤器单元顶部和过滤器。使用制造商提供的无菌帽密封过滤器单元的底部。容器应仅在BSC内打开。
钩线虫的制备
1. 使用标准低通量的体外毒力培养物。 interrogans），在EMJH培养基中保持在28-30℃，之后到达在生长曲线中的稳定期
2. 在开始外科手术之前，通过暗视野显微镜计数细菌
3. 使用新鲜的EMJH培养基将培养物稀释至10 6个有机体/ml。
4. 在BSC中工作，将10ml的EMJH + BSA转移到无菌的50-ml锥形管中。每个DMC准备一个锥形管。
  注意：重要的是补充用于DMC的EMJH培养基额外的BSA保持适当的渗透压。
5. 将0.1ml稀释培养物加入到含有EMJH + BSA培养基（终浓度，10μL/ml）的每个50-ml锥形管中。
DMC的制备
1. 在BSC工作，放置几个一次性，单独包装血清学移液管在手术领域。放下一个无菌悬垂用作工作区。使用自动移液器清洁表面 70％乙醇并置于无菌悬垂物上。后穿了一双新的无菌手术手套，松开一个50毫升锥形管的帽。
2. 当仍然戴上手套时，小心地从其中移除一条管储存容器使用钝端钳。用你的自由手举行食指和拇指之间的管道。用其他手，删除帽从含有稀释的细菌和转移的50-ml锥形管使用10ml一次性血清移液管向管中加入高达9ml。在继续保持开口端的同时，压平未填充的管在你的手的手指之间消除任何气泡。
3. 轻轻扭曲管道的顶端（1-2圈）以除去任何剩余空隙体积和关闭DMC的顶部使用你的拇指和食指握住扭曲区域以防止液体当你打开顶部时，从DMC中泄漏出来。绑在开放端使用简单的反手结（例如，在DMC的顶部形成循环，使管的自由端通过环，然后，没有松开你的拇指和食指，轻轻地拧紧结）。修剪用无菌剪刀将多余的管子从绑扎端取下注意：尝试使DMC尽可能拉紧; 这将有助于机动在手术期间进入腹膜腔。结果填满 DMC应为〜1.5 - 2 in。较大的DMC可能会干扰正常肠或膀胱功能。
4. 将填充的DMC置于含有〜5-7ml新鲜的EMJH + BSA培养基的无菌50-ml锥形管中。
5. 重复步骤C3-4，直到所有袋子都填满，然后直接进行手术。
  注意：不建议储存填充的透析膜室延长的时间，因为这可能增加的风险污染。
腹膜植入程序。
1. 通过肌内注射氯胺酮/赛拉嗪混合物麻醉动物
2. 对每只眼睛涂少量眼膏。
3. 管理术前止痛（例如，Carprofen）。
4. 剃刮腹部并准备手术部位（例如，用Betadine外科溶液，随后用酒精连续洗涤）。
5. 用无菌纱布覆盖手术部位，并将动物以仰卧位置转移到BSC
6. 在开始手术前，取出覆盖的无菌纱布手术部位和执行"脚趾捏"，以确保动物是适当麻醉。
7. 使用无菌手术刀刀片，做一个5厘米切口只通过皮肤，开始〜2.5厘米以下的胸腔，使用剑突过程作为指南。使用组织钳，拉起皮肤在切口的任一侧并轻轻地修剪筋膜使用解剖刀将皮肤连接到腹壁。重复上另一侧
8. 使用相同的手术刀，做一个小切口（〜4厘米）在腹壁，使用 alba 作为指南。切口应该干净，直。
9. 使用组织钳，抬起一边的腹部切口并将DMC置于大鼠腹膜腔内（图1）。轻轻地将DMC推向腹膜的任一侧以防止其在缝合期间被切刻/破裂。确定以便其不会缠结在肠中或干扰膀胱扩张。
图1.将DMC植入大鼠腹膜腔中
1. 通过缝合闭合腹部切口部位。从缝合开始每端切口有双结。向上工作，关闭通过放置缝合约2-3毫米留下切口
2. 关上皮肤切开部位使用连续的AutoClip ^®伤口夹（图2）。注意：或者，可以关闭皮肤切除部位使用表面下的缝合，然后是液体皮肤粘合剂（例如， Nexaband）。
图2.关闭皮肤切口
1. 将大鼠放在干净的手术巾的顶部，在一个干净的笼子里含新鲜床上用品。将笼子放在循环水的顶部加热垫保持适当的核心体温。监控动物不断地直到警觉和反应。
2. 止痛应该在手术后至少两天给药。
3. 在第一周应至少每天监测动物一次术后，然后每隔一天。如果动物显示任何痛苦或不适的迹象，咨询机构兽医工作人员马上。
从DMC中恢复哺乳动物宿主适应性生物体
1. 在植入后9至12天，通过CO 2窒息对动物实施安乐死。
2. 将动物放在BSC卧位。
3. 使用无菌手术剪刀，暴露腹壁。
4. 使用无菌组织钳，抬起缝合的腹部切口部位的一侧，并使用无菌剪刀重新打开。
5. 使用钝端钳定位和取出DMC。转移到无菌的50毫升锥形管。
6. 使用无菌镊子保持DMC一个结，做一个小切在管子正下方结。慢慢删除DMC的内容使用无菌一次性血清移液管。将DMC流体转移到无菌15-ml锥形管。或者，DMC内容可以是使用注射器18-G，1英寸针头连接到无菌的10ml 注射器。然而，通过注射器吸入钩端螺旋体可能破坏细胞和/或引起细胞裂解。
7. 在暗视野显微镜检查下，从每个腔室检查一小部分内容物DMC流体
8. 进行下游应用（例如，RNA分离，通过1D和2D SDS-PAGE分析）。

代表数据

图3.在透析膜腔室内生长期间，毒性钩端螺旋体成为哺乳动物宿主适应的。在30℃下在EMJH培养基中在体外（IV）和在植入雌性Sprague-Dawley大鼠的腹膜腔中的透析膜室（DMC）内在EMJH培养基中培养至晚对数期的螺旋体的代表性全细胞裂解物。 A.根据螺旋体数目（每个泳道5×10 6个）或总蛋白质（每个泳道5μg）加载裂解物并用SYPRO Ruby凝胶染色剂染色。箭头和星号用于突出多肽的实例，所述多肽的表达在体外与DMC相比在体外显示分别增加或减少。分子量标记在左侧显示。 B.使用针对Sph2的兔多克隆抗血清（Matsunaga等人，2007），LipL32（Haake等人，2000）和LipL41（上海）的免疫印迹分析， et al。，1996）。箭头用于指示SphH的预测分子量的带，第二，密切相关的鞘磷脂酶在L中。（Matsunaga等人，2007; Carvalho等人，2010）通过针对Sph2的抗血清识别的抗原特异性抗体来自Caimano等人的图片（2014）。

食谱

氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉剂
库存解决方案
100mg/ml氯胺酮-HCl 20mg/ml甲苯噻嗪-HCl
EMJH + BSA培养基
准备1-L的EMJH培养基，如补充数据中所述和先前公布的（Zuerner，2005）
使用分析天平
减去10mg BSA 在持续搅拌下在10mg BSA中缓慢搅拌，避免气泡，直到BSA完全溶解为止使用0.22μmStericup 过滤单元
过滤灭菌储存在4°C

致谢

作者感谢Anna Allard女士的杰出技术援助，并感谢Justin Radolf博士继续支持我们的工作。这项工作由NIH Grants AI029735（MJC），巴西CNPq拨款481133/2011-9和483052/2012-4（AJAM）和CNPq/SWE/CSF拨款246433/2012-4（AAG）支持。

参考文献

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