材料和试剂

300 ng /μl质粒DNA 我们使用从E中纯化的7.2kbp pMK 3质粒。通过QIA过滤器的大肠杆菌JM109使用通过QIA过滤器TM （Plasmid Midi试剂盒）从大肠杆菌JM109纯化的7.2kbp pMK3质粒。需要超级螺旋形式丰富的高质量质粒来监测超螺旋形式的还原。
要测试其DNA保护能力的蛋白质
一个。 BSA（Wako Pure Chemical Industries，目录号：01317843）
b。溶菌酶（Wako Pure Chemical Industries，目录号：12202673）
琼脂糖
溴化乙锭（EtBr）（Invitrogen，目录号：15585011）注意：溴化乙锭是有毒和强诱变剂。使用合适的手套，护目镜和实验室外套。
硫酸亚铁铵（1.5mM）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：01412172）
注意：解决方案必须在实验之前准备好。
200mM过氧化氢（Wako Pure Chemical Industries，目录号：08104215）
NaCl（Wako Pure Chemical Industries，目录号：19101665）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：08104215）
Tris（Nacalai tesque，目录号：3543421）
乙酸（Nacalai tesque，目录号：0021243）
EDTA（Nacalai tesque，目录号：15111）
CIA（氯仿：异戊醇= 24:1）（Nacalai tesque，目录号：0840255）
注意：氯仿是可疑的诱变剂，吸入会有害。避免吸入蒸气和长期接触皮肤，使用烟气食品和安全手套。按照您所在学院的安全规则。
300 ng /μl质粒DNA（pMK3）（参见配方）
1μg/μl牛血清白蛋白（BSA）（见Recipes）
1μg/μl溶菌酶（见配方）
蛋白质/结合缓冲液（见配方）
1.5 mM硫酸亚铁铵（见配方）
200 mM过氧化氢（见配方）
10％十二烷基硫酸钠（SDS）（参见配方）
1x TAE缓冲区（请参阅配方）
50x TAE缓冲区（请参阅配方）

设备

Eppendorf管（1.5ml）
Eppendorf管（2.0ml）
提示
恒温槽
离心机
电泳仪
UV Trans照明器和记录系统（Nippon Genetics，型号：例如FAS III系统）

软件

图片J（NIH）（ http://imagej.nih.gov/ij/）

程序

在30μl蛋白质结合缓冲液中预孵育具有或不具有蛋白质样品：MrgA，MrgA *，BSA或溶菌酶（10和20μg）的质粒DNA（300ng pMK3）：在37℃下1小时。 />
加入8μl1.5 mM新鲜的硫酸亚铁铵溶液，轻轻混合样品，通过移液，然后在室温（25°C）孵育5分钟。
注意：在这个时间标度下加入过氧化氢之前，氧气对二价铁的氧化没有明显进展。这个在我们的实验中的5分钟孵育是允许MrgA在其核心中螯合亚铁。
加入2μl200mM过氧化氢（最终浓度为10mM），并通过移液轻轻混合样品，然后在室温（25℃）下孵育5分钟。
加入10μl的10％SDS和50μl的CIA，并涡旋。这是为了变性并从DNA中除去蛋白质，并在下一步骤中在水相中回收DNA
通过在≥13,000×g下离心5分钟，在4℃下回收上清液
在TAE缓冲液（无EtBr）中的1％琼脂糖凝胶上分离20μl上清液，并在室温下在100V电泳40分钟。电泳后，将凝胶浸泡在含有EtBr的TAE缓冲液中以显现DNA
使用NIH图像J软件测量超螺旋DNA的信号强度。详细：
1. 通过紫外透射照明器和CCD相机采取琼脂糖凝胶图像（FASIII系统）。通过常规扫描仪扫描照片副本（如果可以从CCD相机获得高质量的数字图像，可直接使用用于测量。我们扫描了影印件，因为分辨率在FASIII系统的情况下数字图像低）。测量信号超螺旋DNA的强度使用NIH图像J软件。测量每个信号强度减去背景。
2. 使用没有氧化应激的超螺旋质粒DNA的信号强度计算相对信号强度
3. 计算相对强度的平均值和标准偏差来自多个独立实验。评估统计通过学生t检验的显着性
图1显示重组MrgA和MrgA *的结果。如先前所述制备MrgA和MrgA *（Ushijima等人，2014），并且在用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE中它们的纯度高于95％。 MrgA具有铁氧化酶活性和DNA结合活性，而MrgA *的铁氧化酶活性受损。作为阴性对照，可以使用1μg/μl牛血清白蛋白（BSA）或1μg/μl溶菌酶（参见配方）。

图1.代表性数据。A.超螺旋质粒DNA的相对量。显示了无蛋白质（n = 9），MrgA（n = 4），MrgA *（n = 3），BSA（n = 6）和溶菌酶（n = 4）的平均值和SD值。所有蛋白质均为10μg。 *：在t检验中与氧化应激暴露（泳道2）相比显着差异，p < 0.05。 ns：不显着，p> 0.25。 B.DNA保护测定的代表性凝胶图像。泳道1：没有氧化应激的质粒DNA。泳道2：用氧化应激（Fe 2+ +/H 2 O 2 O 2）处理的质粒DNA。泳道3〜6：在Fe 2+反应之前，将质粒DNA与10μgMrgA（泳道3），MrgA *（泳道4），BSA（泳道5）或溶菌酶（泳道6） sup>添加。 SC：超线圈，N：镀镍。 MrgA的DNA保护依赖于完整的铁氧化酶活性，而MrgA *的DNA结合对DNA保护没有贡献（Ushijima等人，2014）。

笔记

我们证实，至少Tris或HEPES基缓冲液可用于通过Fenton反应介导的氧化应激的DNA切口损伤。
应该新制备1.5mM硫酸亚铁铵，溶解的溶液不应超过pH 7.0（MilliQ水的pH为5.50-6.86）。 pH值大于7.0的溶液立即氧化二价铁到三价铁（Morgan和Lahav，2007）。
注意，信号强度可以根据实验而变化：图1B中代表性图像中的一些信号强度不同于图A中的平均强度。推荐至少三次独立实验和统计评价。为了比较不同的凝胶图像，使用可用于标准化信号强度的参考样品，例如具有已知量的标记DNA。我们采用单边学生t检验。
EDTA可用于停止Fenton反应。然而，当我们在纯化之前试图加入EDTA时，它不增加DNA信号强度，而是产生涂片信号。

食谱

300ng /μl质粒DNA（pMK3）
通过Plasmid Midi Kit提取从大肠杆菌JM109纯化的pMK3 用MilliQ水调节浓度
1μg/μl牛血清白蛋白（BSA）
10 mg BSA
用蛋白质/结合缓冲液
将总体积调整至10 ml
1μg/μl溶菌酶 10mg溶菌酶用蛋白质/结合缓冲液
将总体积调整至10 ml
蛋白/结合缓冲液
20mM Tris-HCl（pH8.0） 200 mM NaCl
1.5mM硫酸亚铁铵
1.17mg硫酸亚铁铵
2ml MilliQ水
200mM过氧化氢
10.2μl过氧化氢（30％w/v）
439.8μlMilliQ水
10％十二烷基硫酸钠（SDS）
10g十二烷基硫酸钠用MilliQ水将总体积调整到100 ml
1x TAE缓冲区
20 ml 50x TAE
980ml MilliQ水
50x TAE缓冲区
242克Tris
57.1ml乙酸 100ml 0.5M EDTA
用MilliQ水将总体积调整为1 L /

致谢

该方案从之前描述的体外 DNA损伤测定（Martinez和Kolter，1997）修改。

参考

Martinez，A。和Kolter，R。（1997）。在非特异性DNA结合蛋白Dps的氧化应激过程中保护DNA。 J Bacteriol 179（16）：5188-5194。
Morgan，B。和Lahav，O。（2007）。 pH对由O 2引起的自发Fe（II）氧化的动力学的影响/sub>在水溶液中 - 基本原理和简单的启发式描述。 68（11）：2080-2084。
Ushijima，Y.，Ohniwa，R.L.，Maruyama，A.，Saito，S.，Tanaka，Y.and Morikawa，K。 MrgA（Asp56Ala/Glu60Ala）的核仁压实对葡萄球菌细胞对氧化应激和吞噬细胞的存活无贡献 FEMS Microbiol Lett 360（2）：144-151。