材料和试剂

研究IMP

磷酸胆碱清洁剂（Avanti Polar Lipids）
Tris Base（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1521）
HCl（Thermo Fisher Scientific，目录号：A144212）
尿素（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP169212）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1201）
L-精氨酸（L-Arg）（Sigma-Aldrich，目录号：A5131100G）
磷酸盐缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：P7994）
叠氮化钠（NaN 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S803225G）
NaCl（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP358212）
展开蛋白的储备溶液（参见配方）
重折叠缓冲区（参见配方）
NMR缓冲液（参见配方）

设备

NMR数据收集

在该方案中使用的NMR实验装置或者是Bruker标准脉冲序列文库的一部分，或者在附录。这些实验在装有微探针的Bruker DRX光谱仪（Bruker Corporation，型号： 1 mm TXI，1.7 mm TXI ）
使用以下实验来监测[2 H]，15 N] - 标记的IMP：2D [15 C] 15 N的水溶液的质量， 1 H-TRO-STE（Horst等人，1997），H-TRO-STE（Horst et al。，2011）和TRACT（Lee ，2006）。

程序

NMR样品制备
1. 加入100微升新鲜制备的解折叠蛋白储备溶液600微升重折叠缓冲液，并在4℃下搅拌过夜。
2. 通过重复稀释/浓缩循环与NMR缓冲液交换。在这些稀释/浓缩过程中洗涤剂的"浓度" 在调节洗涤剂时考虑循环 NMR样品中的浓度。有关如何调整这些的详细信息循环，参见Stanczak等人（2009）。例如，在NMR中的10mM 30-Fos 缓冲液在NMR样品中产生约160mM 30-Fos （Stanczak等人，2012）。
3. 加入5μl的D 2 O和1μl的100mM 的4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸（DSS）的溶液 ¹ H化学物质的内部参考转移到45μl的蛋白质解。
基于2D [1 H] -TROSY实验的不同样品条件的评价。使用以下标准（例如，参见Zhang等人，2008; Stanczak等人，2012年）：
1. 通过比较的IMP的NMR观察的完整性观察到的主链的数目与数字的相关峰预期从氨基酸序列。
2. 高平均峰强度和峰强度分布均匀。
3. 分析峰线形状以支持峰强度测量的解释。
使用H-TRO-STE（Horst等人，2011）和TRACT（Lee等人）对IMP /去污剂混合胶束的流体动力学半径进行评估。，2006）。
1. 使用¹ H-TRO-STE实验确定平移扩散系数 D 。
2. 使用TRACT实验确定旋转扩散系数 D _r。
3. 使用公式 R 计算流体动力学半径 R _h em> _t/4 _r）^1/2。
4. 将样本条件优化为小的R h 值，这有利于记录高质量NMR数据。

数据分析

NMR数据集的处理和分析：
使用Bruker标准软件Topspin处理所有NMR实验。对于所有实验，数据矩阵乘以在H维中的指数窗函数，并且对于2D [¹⁵ N，¹ H] -TROSY在75°的正弦窗口（De Marco和Wüthrich，1976）应用于N维的2D [¹⁵ N， 1 H-TRO-STE数据集。首先使用Bruker标准AU程序 split 分离TRACT数据集的TROSY和anti-TROSY组件，然后使用Bruker积分模块单独积分。使用程序XMGRACE（ http：//plasma-gate）将积分拟合为单指数衰减。 Weizmann.ac.il ）。

笔记

优化用于2D [1 H] 15 H，1 H] -TROSY，1 H-TRO-STE和TRACT实验的NMR采集参数：

对于所有实验
1. 确定高功率射频脉冲的长度如光谱仪用户手册中所述。典型脉冲长度对于^{1 ^{H和¹⁵ N，分别为8μs和35μs。}}
2. 设置载波频率通过最小化残留水到水线 Bruker标准脉冲序列 zggppr 中的信号。
3. 优化水翻转脉冲 sp2 和 sp3 ，使用附录的清单1，以交互方式最小化残留水信号在上采集采集模式。
2D [¹⁵ N，¹ H] -TROSY和TRACT实验（附录的列表2和4）
1. 使用Bruker标准调整WATERGATE软脉冲 sp1 脉冲序列 zggpwg 通过最小化残留水信号以上层交互方式 gs 获取模式
2. Bruker标准脉冲序列 zggppr 中的信号。
3. 优化水翻转脉冲 sp2 和 sp3 ，使用附录的清单1，以交互方式最小化残留水信号在上采集采集模式。
2D [¹⁵ N，¹ H] -TROSY和TRACT实验（附录的列表2和4）
1. 使用Bruker标准调整WATERGATE软脉冲 sp1 脉冲序列 zggpwg 通过最小化残留水信号以上层交互方式 gs 获取模式
2. ...
3. Optimize the [¹⁵N,¹H]-CRINEPT transfer delay, d2, by maximizing the signal from the protein amide moieties in the first increment of the spectrum.
4. Optimize the diffusion delay and the gradient duration, d20 and p30, respectively, using the standard procedures described in the Topspin DOSY application manual, Chapter 2.1.

Recipes

未折叠蛋白的储备溶液
在pH 8.0的20mM Tris-HCl和6M尿素中的[2 H]，15 N]标记蛋白（12mg/ml）
重折叠缓冲区
20mM Tris-HCl，pH7.5 5 mM EDTA
600 mM L-Arg
45 mM洗涤剂
NMR缓冲液
5mM磷酸盐缓冲液，pH 6.8 10mM NaCl，0.3％（v/w）NaN 3
10 mM洗涤剂

致谢

这项工作改编自以前发表的关于E的研究。大肠杆菌外膜蛋白X（OmpX）（Stanczak等人，2009），并用作E的结构测定的平台。大肠杆菌 OmpW（Horst等人，2014）。该方案中描述的程序也用于表征E。在脂质双层纳米圆盘和洗涤剂胶束中的大肠杆菌OmpA（Susac等人，2014）。这项工作得到了路线图计划赠款P50 GM073197技术开发的支持。 KurtWüthrich是Scripps研究所的Cecil H.和Ida M. Green结构生物学教授。

参考文献

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