材料和试剂

单元格
间充质干细胞（来自3-7代的人或小鼠），任何成纤维细胞细胞系（HSMC，3T3）或原代细胞。甚至上皮[BEAS-2b（ATCC，目录号：CRL-9609），NHBE（Lonza，目录号：CC-2540），A549，LA-4，MLE-12]和内皮细胞（HUVEC）效率相对较低。
试剂
1. CellLight Mitochondria-GFP，BacMam 2.0（Life Technologies，目录号：C10600）
2. CellLight Mitochondria-RFP，BacMam 2.0（Life Technologies，目录号：C10505）
3. MitoTracker ^® Green FM（Life Technologies，目录号：M7514）
4. MitoTracker 深红色FM（Life Technologies，目录号：M22426）
5. Alexa Fluor？594鬼笔环肽（Life Technologies，目录号：A12381）或荧光素鬼笔环肽（Life Technologies，目录号：F432）
6. Alexa Fluor 48鬼笔环肽（Life Technologies，目录号：A12379）
7. 用1×PBS稀释的2％多聚甲醛（SigmaAldrich，目录号：P6148）
8. ProLong ^®带有DAPI的Gold Antifade Mountant（Life Technologies，目录号：P36931）
9. 相应的细胞培养基
  1. 用于人MSC（HuMSC），成纤维细胞3T3，A549的DMEM（Sigma-Aldrich，目录号：D5523）+ 10％FBS
  2. 用于小鼠MSC的小鼠MesenCult TM（STEMCELL Technologies，目录号：05512）
  3. Ham's-F12（Sigma-Aldrich，目录号：N6760）+ LA-4，MLE-12的15％FBS
  4. 用于NHBE和BEAS-2b的BEGM（Lonza，目录号：CC3170）
  5. M-199（Sigma-Aldrich，目录号：M2520）+ 15％FBS（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：10270）培养）
10. TritonX-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
11. 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）

设备

Lab-tek II Chambered盖玻片w /盖＃1.5硼硅酸盐无菌（Sigma-Aldrich）
75×25mm显微镜载玻片（J.Melvin Freed Brand）
22 x 22 Esco显微镜方形封面玻璃没有。 1厚度（Erie Scientific Company）
活细胞荧光显微镜（Leica Microsystems，型号：DMI6000）
共焦显微镜（Leica Microsystems，型号：TCSSP5）
BD FACS Aria（BD Biosciences）
BD FACS Calibur（BD Biosciences）

程序

样品准备
1. 典型的小区（例如人类MSC或HuMSC和BEAS-2b）必须首先是分别生长和差异转染（用20μl体积约30000个细胞接种）或CellLight线粒体-GFP， BacMam 2.0和CellLight Mitochondria-RFP，BacMam 2.0。 24小时后，然后共培养各自的细胞。或者它们也可以用来自100μM储备液的2μl/ml（细胞生长培养基）染色的Mitotracker染料在37℃下孵育10-20分钟（例如 HuMSC与MitoTracker DeepRed和BEAS-2b与MitoTracker 绿色）。
2. 染料后孵育，使用1×PBS洗涤含有染料的细胞培养基，并加入新鲜的细胞生长培养基。
3. 对于单细胞群体的活细胞成像，细胞染色任何一种mitotracker染料也可以用鬼笔环肽（F432， Invitrogen或A12381，Invitrogen）在PBS中1:250以观察肌动蛋白构成TNT
4. 细胞必须接种在2-或4-室中载玻片用于活细胞图像采集（每个约10-30,000个细胞）好）。在共培养细胞的情况下，必须有相应的生长培养基以等体积加入。两种类型的细胞以相等的比例接种和3-4小时的共培养，可观察到线粒体捐赠
5. 对于固定细胞免疫细胞化学，染色的细胞必须重新接种到盖玻片上。用70％乙醇洗涤并擦拭玻璃盖并将其置于6孔板的每个孔中。种子30,000个细胞用于单培养或等比例的共培养，然后可以进行染色。细胞必须在2％多聚甲醛中固定（在1x PBS中）在室温下约20分钟或在4℃下过夜和鬼笔环肽可以在透化后（透化缓冲液：0.1％TritonX-100的PBS溶液，15分钟）进行染色（20分钟孵育）。封面玻璃与细胞必须最终安装在玻璃载玻片上 ProLong ^®金防褪色剂。盖玻璃的边缘用指甲油密封。
6. 对于FACS定量线粒体转运，差异染色的共培养细胞必须用胰蛋白酶处理（0.125％胰蛋白酶+ 0.01M EDTA）和细胞沉淀必须在PBS或FACS缓冲液中稀释获得。
比色量化
FACS Calibur/FACS Aria用于获得由MSC转运的线粒体的定量估计。因此确定转运到上皮或其他特定门控细胞群体中的线粒体计数（如在MSC中标记的）。

图像采集
图像采集可以用63x或100x物镜完成，TNT可以用DIC视图成像。各种染料和具有激发和发射范围的相应激光器列表如下：

染料/探针	激光	励磁	发光
MitoGFP	ARGON	488 nm	500-540 nm
MitoRFP	DPSS 561	584 nm	580-620 nm
Mitotracker绿色	ARGON	488 nm	500-540 nm
Mitotracker红色	DPSS 561	575 nm	580-630 nm

食谱

所有试剂，探针和染料在过程中或如制造商的方案中所述重组。

致谢

该研究工作得到了来自科学和工业研究理事会（Government of Scientific and Industrial Research，Govt。）的MLP 5502和BSC 0403授权的支持。的印度。

参考文献

Ahmad，T.，Aggarwal，K.，Pattnaik，B.，Mukherjee，S.，Sethi，T.，Tiwari，BK，Kumar，M.，Micheal，A.，Mabalirajan，U.，Ghosh， Roy，S。和Agrawal，A。（2013）。线粒体形状的计算分类反映了应激和氧化还原状态。细胞死亡 4：e461。
Ahmad，T.，Mukherjee，S.，Pattnaik，B.，Kumar，M.，Singh，S.，Kumar，M.，Rehman，R.，Tiwari，BK，Jha，KA，Barhanpurkar，AP，Wani，，Roy，SS，Mabalirajan，U.，Ghosh，B。和Agrawal，A。（2014）。 Miro1调节细胞间线粒体转运& 增强间充质干细胞拯救功效。 EMBO J 33（9）：994-1010。