材料和试剂

Rosetta DE3 pLysS菌株（Merck KGaA，目录号：70956）
载体pMAL-c2X（New England Biolabs，目录号：N8076S;由NEB销售的载体的当前版本是pMAL-c5X，目录号：N8108S）
蛋白胨（ForMedium，目录号：PEP03）
酵母提取物（ForMedium，目录号：YEM03）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9518）
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（GERBU Biotechnik GmbH，目录号：1010）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
Na 2 HPO 4（Sigma-Aldrich，目录号：71505）
KH sub 2 PO 4（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A6279）（溶液贮存在4℃）
亮肽素（Sigma-Aldrich，目录号：L2884）（1mg/ml的储备液以等分试样在-20℃下储存）
直链淀粉树脂（New England Biolabs，目录号：E8021S）
DNase I（Roche Diagnostics，目录号：10104159001）
甘油（GERBU Biotechnik GmbH，目录号：2006）
乙二胺四乙酸（EDTA）（GERBU Biotechnik GmbH，目录号：1034）
Tris（GERBU Biotechnik GmbH，目录号：1018）
麦芽糖（Merck KGaA，目录号：105911）
超纯水（18.2MΩ）
溶菌酶肉汤（LB）（参见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
列缓冲区（参见配方）
洗脱缓冲液（见配方）

设备

37°C的轨道摇床
分光光度计
冷却离心机
带有MS 73锥形探针（BANDELIN electronic GmbH& Co.，型号：GM70HD）的Bandelin Sonoplus超声波仪
PolyPrep色谱柱（Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec ，目录号：7311550）

程序

表达式
1. 从cDNA获得E4连接酶的蛋白质编码序列并插入载体中的BamHI和SalI限制性位点之间 pMAL-c2，如Tomanov等人（2014）中所述。因此，序列形成连续读框，其将被表示为与MBP（麦芽糖结合蛋白）的N-末端融合
2. 将质粒热休克转化到Rosetta DE3 pLysS菌株中
3. 5毫升LB与15毫克/升氯霉素和100毫克/升的文化接种氨苄青霉素并在37℃下振荡生长过夜 200 rpm。
4. 第二天早上，将来自过夜培养物的500μl接种到具有相同抗生素的200ml新鲜LB中
5. 将培养物在37℃下以200rpm振摇温育，直到OD 600达到0.6（约3小时）。
6. 取出500μl样品用于电泳分析并储存在4℃。通过加入IPTG至终浓度诱导培养物为1mM。
7. 在37℃下3小时后，再加入500μl样品取出并在4℃下储存。通过离心收获培养物它在4℃和4500xg下20分钟
8. 将沉淀重悬浮于PBS（pH 7.4）中，并在4℃和4,500xg下再次离心20分钟。
9. 将沉淀在-20℃下冷冻过夜。
净化
1. 将冷冻的沉淀在冰上解冻。
2. 五毫升预冷柱缓冲液，以及抑肽酶和亮肽素，终浓度为1μg/ml
3. 15分钟后冰，使用Bandelin Sonoplus HD70超声波仪裂解细菌带有MS 73锥形探头（在冰上）。施加超声波脉冲三次，30秒，在冰上中间冷却，并且具有60％强度，50％准时。
4. 将悬浮液在4,300×g，4℃下离心20分钟。
5. 在离心过程中，使用BioRad PolyPrep色谱柱（2 ml床体积）通过加入200μl直链淀粉树脂来制备。
6. 的树脂用3柱体积（cv）水洗涤并用6平衡 cv列缓冲区。将柱的下端加盖离心上清液与10μgDNase I一起加入。不需要与DNA酶I预孵育。
7. 将柱密封并在4℃下在旋转轮上温育30-60分钟
8. 收集流出物并用24cv柱缓冲液洗涤柱。
9. 用3×1 cv洗脱缓冲液洗脱蛋白质，并用甘油洗脱加到洗脱液中至终浓度为20％v/v
10. 的检查洗脱蛋白的纯度和浓度 SDS-PAGE，并将级分在液氮中快速冷冻并保存 -80℃。

代表数据

图1.表达和纯化MBP-PIAL2后的代表性结果将10μl每种级分与10μlLaemmli样品缓冲液（Laemmli，1970）混合，在95℃煮沸5分钟，然后在10％SDS-PAGE凝胶上。通过离心500μl培养物并向沉淀物中加入50μlLaemmli样品缓冲液来制备非诱导（NI）和诱导（I）级分。将20微升施加在凝胶上。组分名称如下：NI-非诱导的，I-诱导的，SN-上清液（超声处理后），FT-流通（在直链淀粉树脂培养后），W-洗涤，E-洗脱。游离MBP在诱导级分中已经可见，并且可能是体内蛋白水解事件的结果。

笔记

关于SUMO化和所涉及的酶的更详细的解释由Tomanov等人（2014）描述。
从NEB产品的通常质量来看，使用当前版本的pMAL载体不会出现任何问题。
PBS可以制备为10x原液;需要在使用前过滤。
柱缓冲液可以在4℃下储存长达一个月。洗脱缓冲液可在-20°C下储存6个月。新鲜制备的缓冲液有最好的效果。
当储存在-80℃时，两种蛋白质融合物（MBP-PIAL1和MBP-PIAL2）都是可溶的并且保留其体外的SUMO化几个月的活性。 pMAL-c2X载体含有因子Xa切割位点，因此可以通过柱内消化来进一步纯化蛋白质用于晶体学研究。
对于Western印迹检测，NEB提供了目录号为E8032S的MBP特异性抗体

食谱

溶菌酶肉汤（LB）（高压灭菌）
1％w/v蛋白胨 0.5％w/v NaCl
0.5％w/v酵母提取物
pH 7.2
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（无菌过滤）
137 mM NaCl 2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
2mM KH 2 PO 4 sub/
pH 7.4
柱缓冲液（无菌过滤）
20 mM Tris
200 mM NaCl
1mM EDTA
pH 7.4
洗脱缓冲液（无菌过滤）
20 mM Tris
200 mM NaCl
1mM EDTA
10mM麦芽糖 pH 7.4

确认

在奥地利实验室的工作由奥地利科学基金会FWF（授予P25488-B22）支持。

参考文献

Laemmli，U.K。（1970）。在噬菌体T4头部装配过程中切割结构蛋白。自然 227（5259）：680-685
Tomanov，K.，Zeschmann，A.，Hermkes，R.，Eifler，K.，Ziba，I.，Grieco，M.，Novatchkova，M.，Hofmann，K.，Hesse，H.and Bachmair， 2014）。拟南芥PIAL1和2促进SUMO链形成为E4型SUMO连接酶，并参与胁迫反应和硫代谢。植物细胞 26（11）：4547-4560