Zudaire，E.，Gambardella，L.，Kurcz，C.and Vermeren，S。（2011）。血管网络定量分析的计算工具 PLoS One < em> 6（11）：e27385。

... 下载可以指定如肽序列或编码序列。默认情况下，选择所有基因模型，然后选择这些可以作为输入文件的单个FASTA文件下载后续步骤。

假设草稿质量转录本注释，需要消除冗余基因模型在multiseq FASTA文件中。 GRASSIUS网站提供自定义perl脚本"IdentifySeqRedundancy.pl" （ http://grassius.org/tools.html ）。这个脚本也需要的Perl模块"Digest :: MD5"可以从综合Perl归档网络（CPAN）网站（ http://search.cpan.org/dist/Digest-MD5/MD5。 pm ）。一个也可以消除使用BLAST搜索的物种内的冗余模型。蛋白质如果它们在同一物种中发现，则任意地被认为是重复的，查询覆盖率≥90％，或者查询身份≥90％查询比对从起始密码子开始少于9个残基。或者，可以使用更复杂的标准，例如Gu等人，2002，可以用于鉴定基因组中的重复蛋白。如果这些条件满足时，保留最长的蛋白质并消除蛋白质被分类为相同或剪接变体。如果有访问RNA-Seq数据集，他们可能用于证实目标TF 基因模型，但这种方法在这里没有概述。定位最长剪接变体，其由EST或RNA-Seq数据支持提供了最大的蛋白相互作用空间，用于鉴定蛋白质-DNA和蛋白质 - 蛋白质相互作用网络。

扫描非冗余multifasta 文件作为隐藏的Markov模型的蛋白质结构域的集合（HMM）（例如由PFAM或Interpro提供）提供蛋白质结构域注释的推定蛋白质组。对于这个特定的步骤需要软件HMMER。简而言之HMMER是一套工具实现配置文件隐藏马尔可夫模型以找到相似性蛋白质序列，并且是搜索PFAM HMM模型所必需的蛋白质序列组。有可能从一个品种调用HMMER 的脚本语言，如perl或python，使用预构建HMMER 包装。 PFAM提供了以perl编写的那些脚本之一（pfamscan.pl）与一组PFAM预先建立的参数。源代码可从以下网站下载： ftp：//ftp。 sanger.ac.uk/pub/databases/Pfam/Tools/PfamScan.tar.gz 。表格1 是已经用于定义TF的蛋白质结构域的汇编和植物中的CR家族（Buitrago-Florez等人，2014; Burdo等人， 2014; Perez-Rodriguez等人，2010; Yilmaz等人，2009）。这个表描述了用于定义基因的62个TF和26个CR家族包括在玉米TFome中的模型。其中12个家庭没有具有归属的PFAM域，但可以使用"内部"HMM来定义（Buitrago-Florez et al。，2014; Perez-Rodriguez et al。 al。，2010）。 CCAAT-Hap2,3和5 TF家族的HMM可以是从AGRIS数据库获取（ http://arabidopsis.med.ohio-state.edu ）（Yilmaz等人，2011）。

一旦基本模型的主要列表注释与蛋白质域，他们分配到TF或CR家庭使用表1中列出的标准。标准包括识别一个或多个基序的存在和其他（禁止的）图案（Buitrago-Florez等人，2014; Perez-Rodriguez等人，2010; Yilmaz等人，2009）。注释涉及自定义perl脚本 "get_InterProScanDomains.pl"将蛋白质分类为TF家族 interproscan输出，可在GRASSIUS网站上获得（ http://grassius.org/tools.html ）。脚本只保留重要的命中 e值≤0.001，并验证规则如表1所示满足。当规则只是部分满足时蛋白质被分配到"孤儿"TF。这可以是最大的类 TFs为一个物种（〜11.7％的玉米TFome），直到孤儿成员分配给家庭。

可以进行本地搜索计算资源或当iPlant不可用时协作发现环境公共资源（ http://www.iplantcollaborative.org ）。

筛选质粒模板的EST或flcDNA集合

确定哪些cDNA资源可用于目标基因组（见注1）。模型物种的大多数基因组项目包括产生 EST文库，虽然许多库不是公开的。对于玉米TFome，广泛使用玉米flcDNA收集（ http://www.maizecdna.org ）（Soderlund 等人，2009）。个人用于该文库和许多其它植物物种的cDNA克隆是可获得的通过亚利桑那大学基因组学院（ http://www.genome.arizona.edu ）。
使用基因模型的编码序列作为查询序列，然后使用BLASTP或BLASTX鉴定EST或flcDNA，其中存在氨基末端，包括起始密码子序列比对> 99％。不是100％相同的对齐可能发生，因为EST序列由于测序而不是高保真特别是在序列的3'末端的错误（Soderlund等人，2009）。可选择的剪接同种型不由转录模型表示也可以是目标，只要它们保持阅读框架原始成绩单。
一旦找到可能的flcDNA模板，然后从每个末端获得，分离和测序质粒确认：a）它是正确的模板，b）它是全长。一些cDNA文库在其构建期间利用酶进行切割在导致部分克隆的编码序列内不适合于整个编码序列的扩增。
一旦鉴定靶基因的合适的靶质粒模板，然后a 样品稀释至1ng /μl，1ng作为模板在a中足够 PCR反应。

其他试剂

One Shot ^？ TOP10化学感受态细胞（Life Technologies，目录号：C404003）
PureLink 植物RNA试剂（Life Technologies，目录号：2322-012）
Turbo DNA-free TM 试剂盒（Life Technologies，Ambion ，目录号：AM1907）
Thermo Scientific Maxima H minus 1 链合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：K1652）
Ribolock？RNase抑制剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：EO0382）
EmeraldAmp MAX PCR Master Mix（Takara Bio Company，目录号：RR320A）
Phusion 高保真聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0530S）
或者pENTR TM/SD/D-TOPO载体（Life Technologies，目录号：K243520和/或pENTR TM/SD-D-TOPO） K242020）
Genscript Taq聚合酶（GenScript USA Inc.，目录号：E000071000）
EmeraldAmp MAX PCR Master Mix（Takara Bio Company，目录号：RR320A）
1kb梯度分子量大小标准品（Thermo Fisher Scientific，目录号：SM0311）
RNA提取缓冲液I（参见配方）
RNA提取缓冲液II储备溶液（参见配方）
RNA提取缓冲液II（工作溶液）（参见配方）
Carlson裂解缓冲液（参见配方）
冷冻介质（见配方）

设备

注意：这里列出的大多数设备是大多数实验室中存在的标准分子生物学仪器。一个大的TFome项目也将受益于使用多通道pippetters和96孔板格式化实验。

微量离心机
高速离心机
梯度热循环仪
凝胶电泳设备
水浴
-80℃冰柜用于储存库存
建议用于所有DNA操作和克隆实验的气溶胶移液器吸头
Wizard SV96质粒DNA纯化系统（Promega Corporation，目录号：A2255）
向导^® Plus SV Minipreps DNA纯化系统（Promega公司，目录号：A1330）
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega Corporation，目录号：A9281）。
基因合成（Life Technologies）
2ml 96孔培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：12566121）
透气板密封（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB0718）
0.5ml平板（USA Scientific，目录号：18965000）
7 mm大小的硅胶密封，可重新高压灭菌（Thermo Fisher Scientific，目录号：0339649）
矩阵样品储存系统（matrixtechcorp.com，Thermo Fisher Scientific，目录号：4111MAT）（Capit-All capper/Decapper），3740（条形码螺旋盖管）和4477（螺旋盖盘）
（可选）用于96孔质粒制备的Vac-Man ^？ 96真空歧管（Promega公司，目录号：A2291）
（可选）能够产生38-51厘米Hg或等效物的真空泵

软件

OligoAnalyzer 3.1软件（ www.idtdna.com ）

程序

用于PCR的核酸模板的制备
这里，使用用于扩增TF编码序列的模板的三个主要来源：1）来自代表性cDNA文库的全长cDNA克隆，2）从从多种宿主物种组织纯化的RNA产生的cDNA，和3）来自宿主物种，其适合于从单个外显子基因扩增编码序列。本节提供了制备核酸模板的方法。
1. 质粒模板用于TF ORF扩增。
  任何传统质粒制备将提供足够量的质粒纯度作为PCR扩增的模板。对于玉米TFome 项目中，需要数百个质粒并且96孔形式合意。高通量系统证明是令人满意的 Wizard ^® SV 96质粒DNA纯化系统。这个系统需要一个真空泵能够产生38-51厘米汞柱或等效压力 Vac-Man ^® 96真空歧管。然而，注意到最后这种方法的质粒DNA浓度通常小于自动Sanger双脱氧DNA测序所需的最低限度约50ng /μl。如果质粒模板需要通过验证 DNA测序，然后进行更高产量的方案将需要（例如
  
  Wizard ^® Plus SV Minipreps DNA Purification 系统）。
2. cDNA模板通过逆转录PCR（RT-PCR）进行TF ORF扩增。
  大多数TF基因在其时间和组织特异性基因中受到限制表达模式。当考虑使用RT-PCR时产生扩增子是有帮助的有一些证据其中特定TF最高度表达以最大化的组织成功扩增。对于玉米和一些其他植物物种， qTeller网站（ www.qteller.com ）提供了一个可搜索的资源，显示来自RNA-Seq的基因转录物的相对丰度数据。对于成功扩增的玉米基因，发现他们总是从前三名的组织之一扩增其中他们的表达被认为是最高使用qTeller资源。植物生物学生物分析资源（BAR）（ www.bar.utoronto.ca ）和植物表达（PLEXDB）（ http://www.plexdb.org ）数据库为更广泛的植物物种选择提供类似的资源。
  对于RNA样品的收集，大的植物群体（约100 玉米植物）应该从多个组织种植将需要和收集某些组织（例如开发）耳朵）将需要收获整个植物。对于一些基因，生物和非生物胁迫，或昼夜节律，可能导致转录水平显着增加。在玉米TFome的情况下，发现可以扩增通过RT-PCR衍生的一半以上的克隆从幼苗芽和根（Burdo等人，2014）。
  
  从植物组织中分离RNA
  通过两种方法之一从植物组织中分离总RNA。对于非淀粉组织使用PureLink 植物RNA试剂按照制造商的建议。用于从中分离RNA 淀粉组织，如发育和成熟种子，该方法由Li和同事描述（Li和Trick，2005）轻微修改。为了方便，协议和解决方案配方详细如下。通常，从1克中分离总RNA 组织。
  1. 研磨1克组织在研钵和杵用液体氮。为了成功实施，组织是必不可少的立即在收获时在液氮中冷冻并储存 -80℃。不应允许组织解冻在添加提取缓冲液之前的任何时间
  2. 将粉末转移到无RNA酶的离心管中，用4ml提取缓冲液I，立即剧烈混合
  3. 加入2.5ml苯酚：氯仿混合物（1:1，pH4.7），通过倒置充分混合
  4. 在4℃下以13,000×g离心15分钟。
  5. 转移上层水相（2.5毫升）到一个新的无RNA酶离心机管中装有2.5ml提取缓冲液II。样品通过混合温和倒置并在室温下温育10分钟
  6. 加入2ml氯仿 - 异戊醇（24:1），充分混合，并在4℃下将样品在13,000×g离心15分钟。
  7. 回收上清液（4.5ml），加入3ml异丙醇和2.5 ml的1.2M NaCl。通过温和倒置混合样品，温育冰15分钟，并在4℃下以13,000×g离心15分钟。
  8. 弃去上清液，用400μl70％乙醇小心洗涤沉淀
  9. 在室温下干燥经洗涤的沉淀物，并在-70℃下储存之前重悬于不含RNase的水（约500μl）。
    通常，总RNA的产量为2.2±0.9μg/μl，其中A 260和A 280为 A n 260/a/230比率分别为1.93±0.06和2.32±0.32（n = 30）。比率<1.7和2.0的总RNA样品被认为不适合。 RNA完整性必须通过在变性凝胶上分离来评估。的可接受质量的总RNA的出现显示在图2A中。对于大多数组织，大和小核糖体带应该是锋利的上带是下带的强度的两倍。微弱延伸在核糖体条带上方和下方的涂片是指示的 mRNA。对于发芽的种子，核糖体条带将减少强度，但涂片应该仍然可见。一些大分子重量物质指示被除去的污染DNA DNase处理（见下文）。
基因组DNA的分离
对于编码序列包含在一个外显子（约7％的玉米中的TF基因）内的TF基因，总基因组DNA是扩增子产生的合适模板。源材料应与项目中使用的参考基因组匹配。这将允许用户辨别扩增子中的单核苷酸多态性（SNP）是否是由于扩增过程中的错误，而不是由于种质中天然存在的SNP。有许多合适的基因组DNA分离方案可用，本项目中使用的方法总结如下植物DNA分离方案（从Carlson等人修改，1991）。
1. 用冷的研钵和杵研磨1g液体氮中的叶材料
2. 将地面材料转移到含有10的无菌Oakridge管中 ml的预热至70℃的Carlson缓冲液（通过静置在水浴中）
3. 在70℃下通过在水浴 - 倒置中孵育20分钟每隔几分钟混合内容物（使用摇动水浴如果可用）。
4. 将样品冷却至室温，加入5毫升氯仿/异戊醇（24:1）并涡旋振荡20秒。然后在4℃下以5,000xg离心10分钟。
5. 转移上水相置入新鲜（无菌）Oakridge管中。加入50μl的10 mg/ml RNA酶A（预煮沸并在-20℃冷冻） - 在37℃孵育 20分钟以降解RNA
6. 加入等体积的异丙醇（2-丙醇），涡旋并在室温下孵育20分钟允许DNA沉淀。在4℃，5,000x下离心20分钟 g 。
7. 将沉淀重悬在600μlTE（1mM Tris，0.1mM EDTA，pH8.0）中，并转移到Eppendorf管中。
8. 加入5微升的10毫克/毫升核糖核酸酶A，并在37℃下孵育30分钟
9. 用等体积的DNA提取DNA 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）中，并在4℃下以14,000×g离心5分钟。
10. 将顶部水相转移到新的Eppendorf管中。用等体积（现在约0.5ml）提取氯仿/异戊醇（24:1）并在14,000×g离心5分钟在台式微量离心机（4℃）中
11. 通过加入沉淀DNA 1/10体积的3M NaOAc或5M NH 4 OAc和2体积的100％乙醇。通过温和倒置混合并在4℃下以14,000×g离心5分钟。
12. 用70％乙醇洗涤DNA沉淀一次或两次
13. 取出洗涤上清液，让沉淀物空气干燥约10 min，但最好不要让DNA变得完全干燥。重悬将DNA在约200μlTE缓冲液（1mM Tris，0.1mM EDTA，pH8.0）并通过UV光谱法测定浓度。
  DNA分离该方法应具有A <260> /A <280> /A <230>比>>。 2.0。对于复杂的基因组如玉米应该使用100 ng 作为PCR反应中的模板。
从总RNA中产生互补DNA（cDNA）
1. 在产生cDNA之前，重要的是去除任何污染来自总RNA制剂的基因组DNA。在这里项目的Turbo DNA- free™工具包根据制造商的建议。使用四单位的TURBO TM DNase 从20μg总RNA中去除任何污染的DNA。以下在37℃处理30分钟，加入DNase失活基质室温下孵育5分钟后，分离 10,000×g离心。除去上清液并用于a 逆转录反应。
2. 建议高保真逆转录酶用于减少cDNA中的错误其将充当靶基因扩增的模板。我们就业 Thermo Scientific Maxima H minus 1 ^st链合成试剂盒制造商的建议，除了在每个逆转录反应中加入40单位的Ribolock RNase抑制剂。使用该方案，12μlDNA酶处理的RNA（约5μg总RNA）在20μl反应中与提供的寡聚dT引物退火。对于单一PCR，0.5至1μl的该反应是足够的大多数TF基因的扩增。在进行PCR之前，质量通过扩增管家的转录物来评估cDNA 基因。为此目的，低保真DNA聚合酶， EmeraldAmp ^® MAX PCR Master Mix就足够了。对于玉米，1,001 bp 部分的ZmGAPDH（GRMZM2G046804）转录物引物ZmGAPDH_F（5'-ATGCAGGCAAGATTAAGATCGGAATCAAC-3'）和 ZmGAPDH_R（5'-CATGTGGCGGATCAGGTCGAC-3'）。缺少较大的2,817 bp PCR产物证实去除了基因组DNA（图2B）。

扩展TF编码序列

合成引物以扩增相应的ORF而没有各个终止密码子和另外的5'-CACC-3'核苷酸尾加入到正向引物中，用于定向克隆到pENTR TM中载体。对于玉米，就GC分析了1,273个引物对含量和熔融温度（Tm）。 Tm值使用 OligoAnalyzer 3.1软件（ www.idtdna.com ）。正向引物具有平均长度为25±4bp，包括5'CACC尾，这是类似于反向引物（23±4bp）。但是GC 正向引物（62.8±9.1）的含量约高12％反向引物（50.2±11.7）。结果，平均Tm 正向引物比正向引物高约3℃（66±5℃）反向引物（63±5℃）。此外，平均GC含量扩增子为62.4±8.8％，范围为78.9-38.2％（n = 1,411）。由于GC含量相对较高，缓冲区为GC丰富的模板常规用于CDS扩增。当设计引物时应该努力使引物在Tm中具有差异（ΔTm）一对尽可能低。在这个项目中，平均ΔTm为 3.2±4.1℃，然而扩增子成功地获得，即使当 ΔTm高达19℃。

接下来使用a生成PCR产物高保真聚合酶。对于这个项目，Phusion ^®高保真选择聚合酶，因为它表现出大于的错误率比Taq DNA聚合酶低50倍。此外，Phusion ^？聚合酶具有增强的持续性结构域，其需要延伸时间仅为约15秒/kb，我们发现a 延长时间为1分钟对于甚至最长的扩增子也是足够的。玉米基因组中TF的编码序列平均为1,024± 长度为474bp，范围为90至3,705bp。推荐 PCR的初始组成列于表2中使用GC缓冲液和10％甘油是最成功的初始条件（表2，设置A）。如果这个初始条件是不成功，建议接下来调整退火温度（笔记2）。发现添加DMSO或额外的MgCl 2也是如此提高了一些模板的成功率（表2;设置B和C）。 PCR的循环参数如下：单个初始 98℃变性1分钟，25-35个循环的扩增 98℃变性20秒，〜60℃退火40秒，72℃ 延伸15秒/kb，1个最后延伸步骤72℃5分钟。重要的是在完成最终延伸步骤之后取出PCR反应物并处理或储存在-20℃ 直到处理（注3）。循环数取决于模板资源。少至25个循环可以用于从质粒扩增模板，但是当使用cDNA模板时通常需要35个循环。通常，较少的周期数将减少错误的机会由于聚合酶
表2.推荐的PCR组合

		选项
组件（按此顺序添加）	A	B	C
	vol（μl）	vol（μl）	vol（μl）
H sub 2 O	11	15.75 -15	10 - 10.75
GC缓冲液（5x）含有7.5mM MgCl 2·h/v	5	5	5
正向引物（20μM原液）	1	1	1
反向引物（20μM原液）	1	1	1
dNTPs （25mM储液）	1	1	1
MgCl 2（50mM储液）	0	0	0.25 -1.0
甘油（50％股票）	5	0	5
DMSO（100％储液）	0	0.25 - 1.0	0
模板*（质粒，cDNA或DNA）	0.5	0.5	0.5
Phusion 聚合酶*（5U /μl）	0.5	0.5	0.5
总量	25μl	25μl	25μl

*模板量，质粒-1ng，cDNA-0.5μlRT反应，基因组DNA-100ng

一旦PCR完成，产物通过凝胶分离电泳鉴定产品的预期大小。当质粒模板，但是通常观察单个频带当使用基因组DNA或cDNA或当更长的片段时预期更常见的是观察多个频带（图2C）。的存在正确大小的带不是保证正确的编码序列已被扩增，特别是对于基因它们属于存在多个旁系同源物的TF家族。

PCR扩增子的克隆和确认
1. 通过DNA凝胶鉴定正确大小的DNA条带切下电泳并凝胶纯化。有很多合适用于该步骤的纯化试剂盒。对于这个项目，我们使用 Wizard ^® SV凝胶和PCR清理系统。仔细定量纯化结扎前的产品
2. 然后克隆纯化的PCR产物进入Gateway pENTR TM/D-TOPO 或pENTR TM/SD/D-TOPO 载体。这些载体允许克隆轻易转移到备选中表达载体并大大增加TFome的效用采集。根据制造商进行连接推荐的协议，并用于化学转化One Shot ^® TOP 10 感受态细胞。如果需要，可以进行一半的反应尺寸使用推荐的插入向量比例
3. 然后筛选卡那霉素抗性菌落的插入片段正确的大小和方向通过菌落PCR或限制性消化的候选质粒。我们注意到克隆的相当大的变化效率使用Gateway ^®条目克隆试剂盒。这个困难是通过一次使用整个套件克服，以最大化效率。如果克隆效率高，则可以从一个或多个分离质粒DNA 两个殖民地和这些用于确认。然而，发现由于克隆效率的变化，菌落PCR通常是a 更有效的识别插页的方法。
  菌落PCR鉴定阳性克隆
  首先，制备通用目的DNA聚合酶等的主混合物作为Genscript Taq聚合酶，在制造商提供的缓冲液（50μl）中 mM KCl，10mM Tris HCl，pH 9.0,25℃），1.5mM MgCl 2，1％Triton X-100）。还发现EmeraldAmp MAX PCR主混合物适用于菌落PCR）。也可以加入5-10％DMSO。向该混合物中将合适的正向和反向引物加入最终浓度为0.4μM。然后将25μl等分试样加入到孔中单独的PCR管或96孔PCR板。无菌牙签或移液管尖端然后用于隔离单个参考菌落，即首先混合成单个PCR反应管，然后平板a 复制的菌落被筛选。 PCR的循环参数为如下：95℃5分钟的单一初始变性循环，35 循环扩增95℃变性1分钟，〜60℃ 退火1分钟，72℃延伸1分钟/kb。 PCR后产物通过凝胶电泳分离并检查a 产物的预期大小（图2D）。 6-8个殖民地之间由于克隆的变化，对每个克隆进行常规筛选效率（图2D）。用载体建立初始PCR反应特异性正向和反向引物，从而产物被扩增只有当基因以正确的方向插入时。如果是没有产物被扩增，载体和/或基因的多种组合可以测试特异性引物。一旦具有插入物的克隆鉴定，然后制备质粒（见上文）以通过DNA确认顺序。
4. 一旦殖民地产生预期的产物大小在菌落PCR筛选中，克隆插入片段的序列通过单读配对末端Sanger双脱氧测序和将克隆序列与参考基因组的序列进行比较。克隆长于1,200 bp，设计内部引物以完成序列确认。最常见的问题出现在确认是不符合的SNP的发生参考基因组。如果SNP导致沉默突变，或者如果SNP是输入GRAMENE数据库（ www.gramene.org ）作为自然变体，那么认为添加到TFome收集中是可接受的。
5. 重要的是制备每种重复的永久甘油原液立即验证克隆，以避免在生成TFome时出现混淆采集。
罕见的TF转录物的基因合成化学基因合成是证明难以进行PCR扩增的基因的选择。该选项提供的优点是，可以针对在不同宿主中的表达优化密码子使用，以及TFome收集的期望的下游使用，并且生产时间快。然而，目前， 1 kb长。另一个缺点是通过不使用源自植物组织的模板，那么对于特定转录物的存在在体内可能几乎没有或没有直接的实验支持。因此，建议在可能的情况下，在化学合成之前寻找特定基因模型的RNA-Seq支持。
对于玉米TFome项目，约30％的收集是化学合成的（Burdo等人，2014）。使用GeneArt 技术进行基因合成。该技术采用密码子优化过程，其是任何复杂或富含GC的序列所需要的，并增加玉米中的表达。在玉米TFome的情况下，试验性测试显示，与酵母优化的形式相比，玉米优化的构建体在酵母中以较低但显着的水平表达。在玉米原生质体中不同密码子优化的形式之间没有观察到表达的显着差异（Burdo等人，2014）。因此，在玉米TFome的情况下，化学合成的克隆被优化用于在玉米中的表达，其中预期进行大多数下游实验。
一旦合成片段，将它们重悬浮于水中，并克隆到上述D节中描述的相关Gateway 进入载体中。
TFome的存储
鉴于TFome收集的效用，应仔细考虑如何存储和提供TFome收集以供长期分发。玉米TFome通过拟南芥生物资源中心（ABRC）公开获得（ abrc.osu.edu ）。建议创建一个或多个备份TFome集合并存储在单独的位置。以96孔格式存储允许更容易地复制整个文库，但是可以使得个体克隆的分布更加困难。这里我们描述了一种用于存储96孔格式的TFome集合的方法 TFome的低温储存96孔格式
1. 根据提供的配方准备灭菌的冷冻介质其下面改编自Woo等人（1994）。这种介质允许细菌细胞的生长和含有冷冻保护剂生长后直接冷冻培养物。在层流气流中内阁，等分1.8毫升含有适当冷冻介质抗生素加入无菌的2ml 96孔培养皿中。
2. 使用无菌技术，用单个细菌接种96孔板来自板或先前制备的甘油原液。什么时候接种种群，可以有帮助的井的地图以避免错误。用透气板密封板密封适合通风和存储细菌/细胞培养物。放置密封板在37℃下在振荡培养箱中以220rpm过夜旋转适当曝气
3. 由于细胞在其中生长冷冻培养基，这只是一个无菌分装400μl的问题的培养物加入无菌的0.5ml平板中，并将其密封以储存 -80℃。此时可以制作多个永久板。的板可以储存在-80℃下，具有塑料盖或7mm大小硅胶密封，可以重新高压灭菌。永久物也可以在a 96孔格式，允许自动去盖，如Matrix 样品存储系统。

代表数据

图2.代表性数据。植物RNA分离和质量控制，长模板的RT-PCR和菌落PCR的样品结果。 A.通过凝胶电泳分离的DNA酶处理前的总RNA的外观。未降解的RNA样品将显示代表核糖体RNA（泳道1中的带框带）的两条主带和指示mRNA的背景拖尾（泳道4中的箭头）。注意，在发芽的种子中看到减少的核糖体RNA的量，因为胚乳不存活。较高分子量条带指示必须通过DNA酶处理去除的基因组DNA。 Std = Generuler TM 1kb梯度分子量大小标准品。样品如下：-1：来自L13阶段植物的植物支持根，2：来自L13阶段植物的成熟雄花穗3：授粉后2周发育种子4：授粉后1天的整个穗，3周龄植物的5个秧苗根， 6，7和8：在萌发后1,2和7天发芽种子。 B.从在图A中分离的RNA产生的cDNA中扩增GAPDH。1.1kb的单条带指示GAPDH转录物，而如果扩增从基因组DNA发生，则预期4.3kb条带。 Std = Generuler TM 1kb梯度分子量大小标准品，如图2A所示。 cDNA样品来自如图2A所示的相同样品。 C.通过RT-PCR扩增具有长编码序列的TF。通常在RT-PCR期间从总cDNA样品观察到多条带。星号表示被切除并用于克隆的正确大小的条带。样品和预期的扩增子长度如下：-1：GRMZM2G069365,2,127bp，2：GRMZM2G171600,2,526bp，3：GRMZM2G028980,2,742bp，4,5：GRMZM2G160005,3159bp。 Std = Generuler TM 1kb梯度分子量大小标准品，如图2A所示。 D.样品菌落PCR反应。具有星号的泳道代表具有含有预期大小的插入物的克隆的集落。克隆不同基因的成功率的高可变性强调了对基于快速PCR的筛选方法的需要。 Std = Generuler TM 1kb梯度分子量大小标准品，如图2A所示。泳道1-8：来自GRMZM2G140156的扩增子，预期大小为2.6kb。泳道9-16：来自GRMZM2G009478的扩增子预期的片段大小为1.8kb。

笔记

优质flcDNA文库的可用性将是影响TFome项目成本的最重要因素之一。通过RT-PCR扩增来自cDNA的罕见和长的转录物可能是具有挑战性的，长的编码序列的合成可能是非常昂贵的。
如果在初始PCR后没有观察到条带，则推荐将退火温度降低2℃。相反，如果看到多个条带，则建议将退火温度提高2℃
建议不要让PCR反应在扩增循环结束时在4℃下保持任何时间长度，因为这将允许扩增子末端降解并降低克隆效率。

食谱

RNA提取缓冲液I（Li and Trick，2005）            每升            每100 ml
100 mM Tris（pH 8.0）MW 121.14                  ;     12.11g               1.211克
150 mM LiCl MW 42.39                     ;                 6.34 g                0.63克
50 mM EDTA MW 372.24                       ;              18.6 g                1.86克
1.5％2-巯基乙醇                     ;              15毫升                 1.5 ml
RNA提取缓冲液II储备溶液（Li and Trick，2005）           每升               每100 ml
库存0.75 M柠檬酸钠          MW 294.1                                  220.5 g                   22克
库存2 M乙酸钠（无水）pH 4.0 MW 82.03              164 g                    16.4克
注意：需要加温，并使用冰醋酸调节至pH4.0。
库存10％月桂基肌氨酸         MW 293.39         ;                     29.34 g                 2.93克
注意：使用10％储备溶液，需要加热至68℃以溶解。
RNA提取缓冲液II（工作溶液）（Li and Trick，2005）  每升                        每100 ml
4.2 M异硫氰酸胍（w/v）MW 118.16                ;   496.27 g                       49.6克
0.5％月桂基肌氨酸Sigma（10％股票）                  ;      50毫升                       5 ml
1 M醋酸钠（2 M原液）                                       500 ml                      50 ml
25mM柠檬酸钠（0.75M储备液）                                   33 ml                       3.3 ml
Carlson裂解缓冲液（Carlson等人，1991）                                    每升
100 mM Tris-Cl（pH 9.5）MW 121.14                 ;                    12.114克
2％CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）                  ;     20.0克
1.4 M NaCl MW 58.44                    ;                          ;               81.82克
1％PEG 6000或8000                                                            10克
20mM EDTA，MW 372.24（> 5M储液= 18.61g/100ml） 40ml的0.5M原料
需加热溶解CTAB。高压灭菌后，溶液将显得稍微不透明（多云）。
注意：在使用前向管中加入β-巯基乙醇（每10ml中100μlBM）。
冷冻介质（Woo et al。，1994）                 ;                         ; 每升
Luria-Bertani肉汤（LB）粉剂或颗粒剂                              25克
36mM K 2 HPO 4 4 MW 174.2                                                         6.28克
13mM KH sub 2 PO 4 sub MW 136.09                                                       1.8 g
1.9mM Na 3 S 6 H 6 H 5 O 7（2H）2 H 2柠檬酸钠）分子量258.06                 0.5克
6.8mM（NH 4）2 SO 4 SO 4（硫酸铵）MW 132.14                       0.9克
4.4％C 3 H 8 O 3（甘油）MW 92.09                                             44 ml
使用去离子蒸馏水和高压灭菌器在大型培养基瓶中加入1000ml 分别高压灭菌器                                                                 每100 ml
1 M MgSO 4 4·H 2 O（硫酸镁）MW 246.475        ;         24.6克
在即将使用前，无菌地每升冷冻介质中加入0.4ml 1M硫酸镁储备液并旋转混合。此时还应加入适当的抗生素。

致谢

我们赞赏拟南芥生物资源中心（ABRC）愿意接受储存，繁殖和分发的TFome收集品。我们感谢Diego MauricioRiaño-Pachón为基因家族的策划提供的帮助。我们感谢300多名托莱多大学本科生的贡献，他们参加了FIRE（促进研究与教育实验室课程的整合）计划，以及Azam Abdollahzadeh，Andrew Reed，Erik Mukundi，Evans Kataka，Narmer Fernando Galeano Vanegas ，Flavia Santos，Hai-Dong Yu，Jeffrey Campbell，Tina Agarwal，Jennifer Carstens，Katja Machemer-Noonan，Kelly Scarberry，Kango Morohashi，Kristen Belesky，Maria Tobias，Noor Zayed，Thais Andrade和Tomoe Kusayanagi和SiGuE ，http：//www.sigue-caps.org/）研究员米里亚姆米尔斯和吉尔伯特Kayanja，他们在团队克隆的杰出贡献。 Michael dos Santos Brito感谢FAPESP（圣保罗研究基金会）博士后研究金BEPE 2012/20486-2。该项目的支持由NSF IOS-1125620提供给JG，AID和EG。

参考文献

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