材料和试剂

来自野生型C57/BL6小鼠（日本SLC，Inc。）的全血
来自人类志愿者的全血
LPS（大肠杆菌，血清型0111：B4）（Sigma-Aldrich，目录号：L4391）
Polymorphprep ^TM（Axis Shield PoC AS，目录号：1114683）
RPMI 1640培养基（无酚红）（Life Technologies，目录号：32404-014）
胎牛血清（Life Technologies，目录号：12483-020）
ACK（氯化铵 - 钾）裂解缓冲液（Lonza，目录号：10-548E）
SYTOX Green（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：S7020）

设备

玻璃巴斯德吸管（Iwaki品牌，Asahi Techno Glass Corporation）
96孔板（TPP Techno Plastic Products AG）
CO ₂孵化器（SANYO）
荧光显微镜（Olympus，型号：IX71）

程序

人类中性粒细胞的分离
1. 从健康人志愿者获得静脉血（每只6ml）。
2. 用中性密度梯度离心分离中性粒细胞根据制造商的说明书制备多晶型物。
3. EDTA抗凝血（最佳浓度为1.5毫克/毫升的血液）铺在6ml Polymorphprep溶液上并离心在500×g下30分钟。
4. 使用玻璃巴斯德吸管小心收获粒细胞级分。
5. 用2ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤含有粒细胞的沉淀。
6. 在400×g离心10分钟，并将沉淀重悬在1ml PBS中。
7. 当存在时，用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。
8. 将1ml ACK裂解缓冲液加入具有残余红细胞的沉淀。
9. 在室温下孵育5分钟，偶尔吸液。
10. 用2ml PBS洗涤含有粒细胞的沉淀。
11. 在400×g离心10分钟。
12. 将嗜中性粒细胞重悬浮于1ml不含酚红的补充有1％胎牛血清的RPMI 1640中。
13. 通过血细胞计数器测定最终嗜中性粒细胞浓度。将获得约0.5〜1.0×10 7个/ml的嗜中性粒细胞。
14. 通过血液涂片上的May-GrünwaldGiemsa染色评价，中性粒细胞纯度被确认为常规> 90％。
15. 简而言之，将空气干燥的涂片载玻片浸入1ml May-Grunwald溶液中1分钟。
16. 加入等份的磷酸盐缓冲液并孵育3分钟。
17. 倒出污渍，用自来水冲洗载玻片。
18. 浸泡在8％Giemsa溶液中20分钟。
19. 用自来水冲洗载玻片并风干。
鼠白细胞的分离
1. 从麻醉的野生型C57/BL6小鼠的下腔静脉中取出肝素化的血液。
2. 简而言之，打开腹部，识别肾脏之间的下腔静脉。
3. 使用25号针头和1毫升注射器充满50微升肝素防止血液凝固。
4. 将针插入静脉，并缓慢抽取血液，直到静脉塌陷。
5. 将获得约500μl血液。
6. ACK裂解缓冲液裂解红细胞。
7. 将5ml ACK裂解缓冲液加入500μl鼠全血中。
8. 在室温孵育5分钟，偶尔轻轻摇动。
9. 在400×g离心10分钟。
10. 小心地弃去含有裂解的红细胞的上清液。
11. （如有必要，重复步骤B6-10。）
12. 用2ml PBS洗涤沉淀。
13. 在400×g离心10分钟，并将沉淀重悬于1ml上述培养基中（步骤A12）。
14. 在ACK处理后，剩余的血细胞包括白细胞（白细胞）和血小板。
15. 最终白细胞浓度通过血球计数器测定。将获得约1.0〜2.0×10 6个/ml的嗜中性粒细胞。
LPS引起的嗜中性粒细胞活化
1. 从野生型获得的人嗜中性粒细胞或鼠白细胞将C57/BL6小鼠悬浮于上述培养基中（步骤A12）。
2. 将它们以1×10 4个细胞/孔（100μl）的密度接种到96孔板（第一个板）中。
3. 用指定浓度的LPS刺激它们（2,20,100，和200μg/ml）。将平板置于37℃的潮湿培养箱中 ℃，CO 2（5％）6小时
通过荧光显微镜可视化的体外NETs。
1. 不对离体活细胞成像进行细胞固定。
2. 细胞不可渗透的DNA结合染料SYTOX Green（激发504 /发射523）是5mM溶液。
3. 要制备10μMSYTOX Green溶液，将2μl5 mM SYTOX Green溶液与1,000μlPBS混合。
4. 向每个孔（含有100μl）中加入100μl的10μMSYTOX Green溶液。
5. SYTOX Green（终浓度为5μM）只能进入细胞当细胞膜受损。因此，SYTOX Green应该染色细胞外DNA和非存活嗜中性粒细胞的核。
6. 添加SYTOX Green后，圆形和纤维结构都可以通过荧光显微镜观察。 SYTOX绿色染色圆结构被认为是非存活中性粒细胞的核。上的另一方面，SYTOX绿色染色纤维结构被认为是胞外DNA，其在该方案中几乎与NET相同。

代表数据

图1.荧光显微镜下的图像（A，C）和光学显微镜下的图像（B，D）。 SYTOX绿色染色的NETs从离体小鼠白细胞）被LPS激活（A）。在光学显微镜下其对应物的图像（B）。 SYTOX绿色染色的NETs从离体的由LPS激活的人嗜中性粒细胞释放（C）。其在光学显微镜（D）下的对应物的图像。

笔记

LPS（大肠杆菌，血清型0111：B4）用于NETs诱导物。在各种血清型（例如B5，B12等）中，B4对于温育时间和获得的结果将是最好的。
为了区分NETs和非存活中性粒细胞，用抗组蛋白，抗中性粒细胞弹性蛋白酶或抗髓过氧化物酶抗体染色将是有用的。

致谢

该协议改编自以前在Tanaka等人（2014）中报道的。这项工作部分得到了日本教育，文化，体育，科学和技术部赠款（KAKENHI 25462052至K.T.）的支持。

参考文献

Tanaka，K.，Koike，Y.，Shimura，T.，Okigami，M.，Ide，S.，Toiyama，Y.，Okugawa，Y.，Inoue，Y.，Araki，T.，Uchida， Mohri，Y.，Mizoguchi，A.and Kusunoki，M.（2014）。表征小鼠脓毒症的各种器官中的中性粒细胞胞外陷阱模型。 PLoS One 9（11）：e111888。